李孝絨 喬光 姜昱雯

摘 要：查爾酮合成酶基因是類黃酮生物合成的關(guān)鍵基因，本文通過巢氏PCR，從‘瑪瑙紅櫻桃的根系組織中克隆獲得一個(gè)1176 bp的查爾酮合成酶基因的cDNA序列，編碼391個(gè)氨基酸，命名為CpCHS2 （基因登錄號(hào)：MT112906）。該基因編碼的蛋白分子量為42.68 kD，等電點(diǎn)為5.76，屬疏水性蛋白且不具有跨膜區(qū)，主要定位在細(xì)胞質(zhì)中，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊為蛋白質(zhì)最大量的結(jié)構(gòu)原件。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，CpCHS2和同屬薔薇科的紅葉李及碧桃的親緣關(guān)系最近，并在進(jìn)化上高度保守。

關(guān)鍵詞：櫻桃;CpCHS2;基因克隆;生物信息學(xué)分析

中圖分類號(hào)：S662.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2021）03-0001-06

國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2021.03.001

Cloning and Sequence Analysis of CpCHS2 Gene in Cerasus Pseudocerasus

LI Xiaorong，QIAO Guang*，JIANG Yuwen

（College of Life Science，Guizhou University/Institute of Agro-bioengineering/Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region Ministry of Education，Guiyang，Guizhou 550025，China）

Abstract：

Chalcone synthetase gene is the key gene for flavonoid biosynthesis.In this paper，a full-length cDNA of the CHS gene was obtained by Nested PCR from the root tissue of Cerasus pseudocerasus ‘Manaohong，whose complete cDNA was 1，176 bp，encoding 319 amino acids，and being designated as CpCHS2 （Gene accession number is MT112906）.The protein encoded by the gene has a molecular weight of 42.68 kD and an isoelectric point of 5.76.It was a hydrophobic protein and did not have a transmembrane region，which was mainly located in the cytoplasm.In the secondary structure，α -helix and β -sheet were the largest structural elements of the protein.The phylogenetic tree analysis showed that the CpCHS2 and Prunus cerasifera and Amygdalus persica of the same genus Rosaceae were closely related and highly conserved in evolution.

Keywords：

Cerasus pseudocerasus;CpCHS2;gene cloning;bioinformatic analysis

類黃酮是一類具有強(qiáng)烈生物活性的多酚類次生代謝產(chǎn)物，它廣泛存在于植物中，除影響植物的生長發(fā)育，還在與環(huán)境相互作用方面起非常重要的作用[1- 2]。類黃酮可以構(gòu)成部分植物防御體系，通過提高過氧化物酶的活力、減少丙二醛含量來消除和減輕逆境引起的活性氧傷害，還可以通過增加脫落酸間接增強(qiáng)植物的抗性[3]。柑橘類黃酮可顯著改善植物對病蟲害的抗性，提高柑橘抵抗逆境脅迫的能力[4- 5]。寧國貴等[6]研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰可通過類黃酮合成相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)類黃酮積累，以此響應(yīng)機(jī)械損傷和氧化脅迫?？梢?，植物體內(nèi)類黃酮在提高植物環(huán)境適應(yīng)性方面至關(guān)重要。

植物類黃酮生物合成來源于苯丙烷類代謝途徑，起始反應(yīng)為查爾酮合成酶（chalcone synthase，CHS）催化4-香豆酰輔酶A和丙二酰輔酶A形成查爾酮[7- 8]?？梢?，CHS酶是類黃酮合成途徑中重要限速酶[9]。CHS基因是一個(gè)較大的基因家族，其保守編碼區(qū)由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成[10]。目前，已有大量關(guān)于植物CHS基因的報(bào)道，王志彬等[11]從10個(gè)柑橘種質(zhì)中克隆獲得了CHS基因，發(fā)現(xiàn)核苷酸序列高度保守，氨基酸序列的多態(tài)性有物種特異性。梅志棟等[12]克隆了杧果CHS1基因，半定量PCR顯示該基因在葉片和花中表達(dá)量較高。張麗群等[13]克隆獲得了3個(gè)茶樹CHS基因，其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)高度相似，推測可能在茶樹不同部位或不同生長階段發(fā)揮類似作用。但迄今鮮見關(guān)于櫻桃CHS基因的報(bào)道。

櫻桃作為深受人們喜愛的春季水果，富含大量的黃酮類化合物[14]。貴州現(xiàn)有櫻桃種植面積已達(dá)33 333.35 hm2。為改善櫻桃生長土壤環(huán)境，課題組前期開展了生物炭應(yīng)用研究，發(fā)現(xiàn)添加生物炭提高了植株的抗性，櫻桃根系轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，生物炭處理下櫻桃根系大量類黃酮生物合成途相關(guān)基因差異表達(dá)，其中CHS基因顯著上調(diào)表達(dá)。本研究擬克隆櫻桃CHS基因并進(jìn)行序列分析，為解析生物炭提高植株適應(yīng)性的機(jī)理奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為櫻桃遺傳改良提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試材料為貴州省主栽品種‘瑪瑙紅櫻桃1年生幼苗，于2019年6月取其根尖，用液氮速凍后，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因克隆

利用植物RNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取根系總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT Reagent Kit（TAKARA）將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。本研究采用巢式PCR的方法，設(shè)計(jì)兩對引物，即根據(jù)轉(zhuǎn)錄組所得序列，通過BLAST比對，在3UTR及5UTR區(qū)設(shè)計(jì)一對引物CpCHS2-F1和CpCHS2-R1;再在其起始密碼子及終止密碼子區(qū)設(shè)計(jì)第二對引物CpCHS2-F2和CpCHS2-R2，引物序列見表1。具體步驟如下，第一輪CpCHS2-F1和CpCHS2-R1為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min;95℃變性50s;56℃復(fù)性15 s，72℃延伸35 s，循環(huán)15個(gè);72℃延伸5 min。作膠回收，再以膠回收產(chǎn)物為模板，第二輪以CpCHS2-F2和CpCHS2-R2為引物，4℃預(yù)變性5 min;95℃變性50 s;56℃退火15 s，72℃延伸35 s，循環(huán)34個(gè);總延伸，72℃，5 min。將巢式PCR獲得的大小合適的單一條帶膠回收后加A尾后至PMD19載體。反應(yīng)完成后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)，挑取10個(gè)單克隆送測序，測序由生物工程（上海）股份有很公司完成。

1.3 氨基酸序列生物信息學(xué)分析

通過DNAMAN進(jìn)行CpCHS2氨基酸序列的比對;通過ProtParam對CpCHS2的氨基酸序列的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析;利用ProtScale對CpCHS2的蛋白親疏水性進(jìn)行分析;通過TMHMM2.0則可以對蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;通過NetPhos 2.0可對CpCHS2蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測;利用SignalP-5.0對CpCHS2的信號(hào)肽進(jìn)行分析;利用WoLFPSORT可預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位;而利用SOPM二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法對CpCHS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測;最后利用Phyre2對CpCHS2蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測解析。利用MEGA6.0構(gòu)建Neighbor-Joining tree（NJ樹），Bootstrap值設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 CpCHS2基因克隆

克隆獲得的櫻桃CHS基因全長1176 bp（圖1），編碼391個(gè)氨基酸，經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫比對后，命名為CpCHS2（Gene登錄號(hào)：MT112906）。利用ProtParam對CpCHS2的基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，該蛋白分子量為42.68 kD，等電點(diǎn)為5.76，其中Leu的含量最高（10.7%），其次為Ala（9.0%）;分子式為C1904H3051N507O566S18，原子總數(shù)為6046;不穩(wěn)定系數(shù)為36.16，脂肪系數(shù)為94.04;估算其半衰期為在哺乳動(dòng)物中為30 h，酵母中大于20 h，大腸桿菌中大于10 h，表明該蛋白較為穩(wěn)定。

2.2 CpCHS2蛋白結(jié)構(gòu)域與氨基酸序列比對分析

利用PFAM對CpCHS2氨基酸序列進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果顯示，該蛋白包括一個(gè)Chal_sti_synt_N（4-228）和一個(gè)Chal_sti_synt_C（238-388）結(jié)構(gòu)域。Chal_sti_synt_N功能為查爾酮和二苯基乙烯的N端結(jié)構(gòu)域，而Chal_sti_synt_C為查爾酮和二苯基乙烯的C端結(jié)構(gòu)域（圖2）。CpCHS2的基因及氨基酸序列如下（圖3）。

利用NCBI的BLAST功能，獲得了包括櫻桃在內(nèi)的17個(gè)植物物種的CHS2基因，并通過DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對。比對結(jié)果表明，CHS2蛋白序列在雙子葉植物不同科屬間高度保守（圖4），序列相似度91%以上;進(jìn)一步構(gòu)建NJ樹（圖5），可以發(fā)現(xiàn)櫻桃的CHS2基因與紅葉李（Prunus cerasifera Ehrh.）及碧桃（Amygdalus persica L.）的CHS2基因分屬同一枝，說明在進(jìn)化上，櫻桃和同屬薔薇科的紅葉李及碧桃的親緣關(guān)系可能更近。另外，CpCHS2和紅葉李CHS2的蛋白序列相似度為99.3%，與碧桃的序列相似度為94%，系統(tǒng)發(fā)育樹與氨基酸序列比對結(jié)果一致。

2.3 CpCHS2蛋白疏水性預(yù)及信號(hào)肽預(yù)測

蛋白疏水性預(yù)測表明（圖6），CpCHS2得分最小負(fù)值為-0.322，最大正值為2.111，總平均親水性（GRAVY）為0.866，根據(jù)負(fù)值越大，親水性越高;正值越大，疏水性越高的標(biāo)準(zhǔn)來判斷，預(yù)測該蛋白屬于疏水性蛋白。

利用SignalP-5.0對CpCHS2蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，CpCHS2蛋白上沒有信號(hào)肽，說明該蛋白并非入核蛋白。

2.4 CpCHS2蛋白跨膜預(yù)測

用TMHMM2.0對CpCHS2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白并非跨膜蛋白，但在其C端有一個(gè)大約30個(gè)氨基酸的跨膜區(qū)，表明其可能會(huì)位于膜上行使功能（圖7）。

2.5 CpCHS2蛋白磷酸化修飾預(yù)測及亞細(xì)胞定位預(yù)測

磷酸化和去磷酸化是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要方式。通過 NetPhos2.0對CpCHS2蛋白可能的磷酸化修飾位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，包括12個(gè)絲氨酸殘基（S），2個(gè)酪氨酸殘基（Y）及10個(gè)蘇氨酸殘基（T）是潛在的磷酸化位點(diǎn)。

利用WoLFPSORT對CpCHS2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其最有可能定位于細(xì)胞質(zhì)中，這與CHS2類黃酮合成的功能是一致的。

2.6 CpCHS2蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過SOPM二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測方法對CpCHS2的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測。結(jié)果表明，CpCHS2的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包括41.43%的α-螺旋，11.25%的β-折疊，30.18%的隨機(jī)卷曲以及17.14%的延伸鏈。對櫻桃的CpCHS2蛋白進(jìn)行了三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖8）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CpCHS2的391個(gè)氨基酸殘基中有388個(gè)殘基（99%）可在已知紫花苜蓿的查爾酮合酶基因三級(jí)結(jié)構(gòu)中覆蓋（置信度100%），說明該三級(jí)結(jié)構(gòu)基本可視為櫻桃CHS2是蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論與討論

CHS基因廣泛分布于植物體中，其家族成員在各物種中數(shù)量不同，如在模式植物擬南芥中僅有一個(gè)單拷貝CHS;LO等[15]對高粱的研究發(fā)現(xiàn)其包含7個(gè)CHS基因以及一個(gè)CHS類似基因CHS8;而最近對桑樹的研究表明CHS基因有5個(gè)成員[9]。多個(gè)CHS基因在同一物種的存在確保了植物可以利用多種底物完成各種生物學(xué)功能。如在大麥中，CHS1以肉桂酰輔酶A和4-酰基輔酶A為底物合成查爾酮，而CHS2則以阿魏酰輔酶A和咖啡酰基輔酶A為底物進(jìn)行合成[16]。最終，通過一系列過程合成的小分子有機(jī)物可行使諸如花色素沉積、紫外保護(hù)以及應(yīng)對各種生物與非生物脅迫的功能。表達(dá)分析表明，桑樹5個(gè)CHS基因成員中，CHS1與CHS2在果實(shí)中高表達(dá)，CHS4主要在根表皮、莖表皮和老葉表達(dá)，而CHS3和CHS5則在老葉中高表達(dá)[9]，說明桑樹CHS基因的表達(dá)部位發(fā)生了分化，從而在不同組織中行使不同功能。

本研究克隆的櫻桃CHS基因由于該基因功能的高度保守性，且其基本上整個(gè)氨基酸序列都分屬兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，因此其氨基酸序列也表現(xiàn)出了高度的保守性。且該基因與紅葉李、碧桃等物種CHS基因家族中的CHS2氨基酸序列相似度在91%以上，因此將該基因命名為CpCHS2。對CpCHS2的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽研究預(yù)測表明，CpCHS2沒有跨膜結(jié)構(gòu)域也沒有信號(hào)肽，說明該蛋白并非分泌蛋白，其主要在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮合成酶功能，這與對龍膽木CHS蛋白的預(yù)測結(jié)果一致[17]。而對CpCHS2的系統(tǒng)發(fā)育分析則表明，櫻桃CHS2和同為薔薇科植物的紅葉李及碧桃在同一進(jìn)化枝，說明這三者的親緣關(guān)系要更近。

CHS基因與植物病菌脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，如高粱CHS8基因在真菌感染時(shí)可參與防御相關(guān)類黃酮合成[15];NAGY等[18]發(fā)現(xiàn)挪威云杉被長喙殼屬真菌感染后CHS蛋白水平顯著提高;大麥的CHS2基因在小麥白粉病感染后表達(dá)量顯著提高[16]。早在1993年，HARRISON等[19]即發(fā)現(xiàn)苜蓿被地表球囊菌感染后CHS基因表達(dá)量在菌根處會(huì)顯著提升，F(xiàn)ERRER等[21]在1999年對紫花苜蓿的CHS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析。本研究獲得的CpCHS2基因，在轉(zhuǎn)錄組中顯著上調(diào)，經(jīng)過蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)其與苜蓿CHS蛋白有85%的空間結(jié)構(gòu)相似度，由此我們推測該基因在響應(yīng)櫻桃病菌感染方面很有可能行使著重要的功能，這將是我們未來的工作內(nèi)容。

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