利惠嬋 黃玉林

結(jié)核病是嚴(yán)重影響人類健康的傳染病之一,雖然近年來已經(jīng)得到了有效的控制,但是目前依舊是全球性的重大公共衛(wèi)生問題之一。有數(shù)據(jù)顯示,結(jié)核病的患病人數(shù)居于世界第二位,及時(shí)進(jìn)行病原學(xué)檢查是有效發(fā)現(xiàn)傳染源,對其進(jìn)行診斷和治療的關(guān)鍵［1］。目前,臨床上對肺結(jié)核患者進(jìn)行診斷時(shí),主要有涂片染色法和羅氏培養(yǎng)法,涂片染色法雖然操作簡單,但是其檢驗(yàn)結(jié)果的陽性率較低,臨床上主要以改良羅氏培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)對結(jié)核病患者進(jìn)行診斷,但是其檢測周期比較長,對其臨床應(yīng)用造成了限制。近年來,隨著分子生物科技技術(shù)的發(fā)展,FQ-PCR技術(shù)被廣泛的應(yīng)用在了對肺結(jié)核患者的診斷中,此種診斷方式對結(jié)核桿菌的敏感性和特異性較高,并且所用的時(shí)間比較短,得到了廣大學(xué)者的認(rèn)可［2］。本次研究選取了92例2018年7月～2019年12月在本院治療的疑似肺結(jié)核患者,通過對其實(shí)施抗酸桿菌檢測、結(jié)核桿菌培養(yǎng)、FQ-PCR技術(shù)檢測,詳細(xì)的分析了FQ-PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌的臨床應(yīng)用價(jià)值。具體如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年7月～2019年12月在本院治療的92例疑似肺結(jié)核患者,采集其痰液(61例)、胸腹水(14例)、腦脊液(17例)標(biāo)本,將標(biāo)本采集后立即送檢,或者保存在4℃的環(huán)境中,但是注意保存時(shí)間<5 d。所有檢測操作都在Ⅱ級生物柜中進(jìn)行。本次研究及時(shí)上報(bào)了本院倫理委員會,并經(jīng)過了批準(zhǔn)。

1.2方法 對采集到的標(biāo)本均進(jìn)行抗酸桿菌檢測、結(jié)核桿菌培養(yǎng)和FQ-PCR技術(shù)檢測。

1.2.1抗酸桿菌檢測 各項(xiàng)操作嚴(yán)格按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》中的相關(guān)要求進(jìn)行。

1.2.2結(jié)核桿菌培養(yǎng) 取濃度為4%的氫氧化鈉溶液,采用無菌操作的手法將標(biāo)本接種于改良羅氏培養(yǎng)基的斜面上,在37℃的環(huán)境下分別進(jìn)行為期3 d和7 d的培養(yǎng),對培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的觀察。之后每周對標(biāo)本的生長情況進(jìn)行觀察,一直到陽性結(jié)果出現(xiàn),或者當(dāng)60 d后無生長則評判為培養(yǎng)陰性。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基上出現(xiàn)明顯的菌落,則立即進(jìn)行抗酸染色涂片,即確認(rèn)是抗酸桿菌,然后進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn),對菌種及藥敏情況進(jìn)行鑒定,對陽性標(biāo)本的培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)參考《結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》中的相關(guān)要求,采用對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基生長試驗(yàn)對培養(yǎng)基中的菌種進(jìn)行鑒定。

1.2.3FQ-PCR技術(shù)檢測 在采集到的標(biāo)本中加入標(biāo)本體積4倍的濃度為4%的氫氧化鈉溶液,液化30 min,采用吸管取0.5 ml置于離心管中,再加入同等體積的濃度為4%的氫氧化鈉溶液,10 min后置于本院全自動離心儀上進(jìn)行離心處理,將離心儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整為3000 r/min,離心5 min,倒出上層清液,在沉淀物中加入1 ml無菌生理鹽水充分的搖勻,再次置于全自動離心儀上進(jìn)行離心處理,將離心儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整為3000 r/min,離心5 min,倒出上層清液,重復(fù)洗滌1次。取50 μl DNA加入沉淀物中,置于沸水中10 min,將其轉(zhuǎn)至4℃的環(huán)境下放置6～8 h,保證DNA的充分裂解。置于全自動離心儀上再次進(jìn)行離心,將離心儀的轉(zhuǎn)速調(diào)整為2000 r/min,離心5 min,取上層清液20 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。在93℃的環(huán)境下進(jìn)行預(yù)變性2 min、93℃45 s、55℃ 60 s,擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)后,再次行93℃ 30 s、55℃ 45 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán),再分別取50 μl陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品,分別加入等量的DNA提取液,將其混合均勻后行沸水浴,之后的處理方式與上述相同。對本次結(jié)果的判定依照檢測試劑說明書進(jìn)行。

1.3觀察指標(biāo) 比較三種檢測方式的檢測結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

92例疑似肺結(jié)核患者中,經(jīng)病理組織學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果顯示82例(89.13%)為陽性,10例(10.87%)為陰性。以結(jié)核桿菌陽性檢出率為評價(jià)指標(biāo),FQ-PCR技術(shù)檢測陽性率為75.00%(69/92),抗酸桿菌檢測陽性率為56.52%(52/92),結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測陽性率為70.65%(65/92)。FQ-PCR技術(shù)檢測及結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測的陽性率均高于抗酸桿菌檢測,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=6.976、3.967,P<0.05)；FQ-PCR技術(shù)檢測與結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測的陽性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.439,P>0.05)。見表1。

表1 三種檢測方式的檢測結(jié)果(n)

3 討論

結(jié)核病屬于臨床常見疾病,由于該病具有傳染性,因此目前世界范圍內(nèi)已經(jīng)將結(jié)核病作為全球嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。目前,在結(jié)核病發(fā)病率方面,世界衛(wèi)生組織估計(jì),全球感染結(jié)核分枝桿菌的人口數(shù)量占全球人口的1/3,且每年因結(jié)核病死亡的患者達(dá)到300萬人,每年新生結(jié)核病患者800～1000萬人。所以,對結(jié)核病患者需積極預(yù)防與治療,這就要求臨床中對結(jié)核病加強(qiáng)診斷,盡早明確患者病情,便于及時(shí)進(jìn)行治療。

在結(jié)核分枝桿菌檢測中,目前臨床中主要采用改良羅氏培養(yǎng)法、痰涂片法、BacTALERT3D及BacTECTB960分枝桿菌快速培養(yǎng)方法等。在大多數(shù)結(jié)核病高發(fā)國家,對其進(jìn)行診斷時(shí)依舊以直接涂片檢查法對抗酸桿菌進(jìn)行檢測,這也是最符合成本效益的方式之一,不但操作簡便,并且用時(shí)較短,一般幾個(gè)小時(shí)內(nèi)就能得到檢測結(jié)果,但是其對抗酸桿菌的敏感性比較低,一般需要5000～10000條菌/ml以上濃度的抗酸桿菌標(biāo)本才能檢出,而對于菌量較少的肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者,其敏感度更低,由于在檢測的過程中,重要對陽性抗酸桿菌進(jìn)行檢測［3］。因此,對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行區(qū)分時(shí)也就顯得比較困難,加上其會導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)不同的疾病,臨床治療方式也存在著明顯的差異,極易導(dǎo)致誤診、錯(cuò)誤用藥的風(fēng)險(xiǎn),對死菌和活菌的區(qū)分也就更加困難［4］。臨床上將結(jié)核桿菌培養(yǎng)法作為結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),其對抗酸桿菌的敏感性比較高,其雖然能夠?qū)罹退谰M(jìn)行判斷,但是所用的時(shí)間比較長,一般2～8周才能得到檢測結(jié)果［5］。隨著PCR技術(shù)的出現(xiàn),Hance等［6］在其研究中,于1989年首先在結(jié)核分枝桿菌檢測中應(yīng)用PCR技術(shù),開辟了以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌檢測中應(yīng)用的時(shí)代。該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中的檢測靈敏度比較高,在1～100 fg純化結(jié)核分枝桿菌DNA檢測中表現(xiàn)出較高的特異性。但常規(guī)PCR技術(shù)在應(yīng)用中因擴(kuò)增產(chǎn)物污染,存在不能定量的問題及假陽性的問題,檢測結(jié)果準(zhǔn)確性受到影響,這也為后來FQ-PCR技術(shù)的出現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。

FQ-PCR檢測法是一種新型的核酸定量檢測技術(shù),其在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上加入了熒光標(biāo)記探針,通過熒光信號的積累對核酸量進(jìn)行測定,如檢測結(jié)果顯示為陽性,則也進(jìn)一步提示標(biāo)本中含有結(jié)核分枝桿菌DNA。熒光定量原理：多數(shù)Tap酶有5’-3’DNA聚合酶活性,在引物引導(dǎo)作用下,其DNA鏈能夠延伸；同時(shí)Tap酶中還有5’-3’外切酶活性,在DNA鏈延伸的過程中,對鏈能夠替換,并切斷被替換掉的單鏈。而熒光定量即是對Tap酶中兩種酶活性的充分利用發(fā)展起來的檢測技術(shù)。此種檢測方式是在全封閉的狀態(tài)下進(jìn)行了PCR的擴(kuò)增,并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了檢測,但是不需要擴(kuò)增后再進(jìn)行開蓋處理,從而有效的避免了擴(kuò)增產(chǎn)物受到污染從而引發(fā)假陽性檢測結(jié)果的出現(xiàn)［7］。此種檢測技術(shù)在對抗酸桿菌檢測的過程中,對抗酸桿菌的敏感度比較高,能夠?qū)?～20個(gè)結(jié)核分枝桿菌菌體的DNA量進(jìn)行檢測,其檢測特異性較高,重復(fù)性較強(qiáng),其檢測結(jié)果明顯優(yōu)于常規(guī)PCR的檢測結(jié)果。一般情況下,只需要2～3 h就能得到檢測結(jié)果,尤其是對生長比較緩慢的細(xì)菌或者培養(yǎng)比較困難的微生物,應(yīng)將FQ-PCR檢測法作為首選。

本次研究中采用了陽性和陰性對檢測結(jié)果進(jìn)行了表示,實(shí)際上,FQ-PCR檢測法能夠進(jìn)行定量檢測,其陽性上限和下限分別為109 copies/ml和80 copies/ml,定量檢測結(jié)果給臨床治療及預(yù)后評估均起到了積極的意義。因此,臨床上也可將FQ-PCR檢測結(jié)果作為對結(jié)核病患者診斷的主要指標(biāo)和臨床篩選指標(biāo),為結(jié)核病的快速診斷提供了有力的指導(dǎo)依據(jù)。極大的縮短了患者等待的時(shí)間,保證了臨床治療的有效性。本次研究結(jié)果顯示,FQ-PCR技術(shù)檢測及結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測的陽性率均高于抗酸桿菌檢測,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；FQ-PCR技術(shù)檢測與結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測的陽性率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。這一結(jié)論對肺外標(biāo)本的檢測也有著極高的價(jià)值,進(jìn)一步提示FQ-PCR技術(shù)能夠有效檢測痰液、胸腹水、腦脊液等標(biāo)本中的特異基因片段,結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測和抗酸桿菌檢測則不能對標(biāo)本中的特異基因片段進(jìn)行檢測。在實(shí)際應(yīng)用中,PQ-PCR技術(shù)在結(jié)核桿菌檢測中對TB-DNA原始拷貝可準(zhǔn)確定量,為PCR技術(shù)發(fā)展提供了新的前景,為肺結(jié)核快速診斷提供了依據(jù)。但目前在臨床研究中,由于研究對象數(shù)量不足,研究結(jié)果可能存在偏差,因此在后續(xù)研究中還需擴(kuò)大樣本量,使研究結(jié)果更細(xì)致、準(zhǔn)確。

綜上所述,臨床上對結(jié)核桿菌進(jìn)行檢測時(shí),依舊以結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測為診斷金標(biāo)準(zhǔn),為臨床用藥、耐藥性檢測等提供了準(zhǔn)確的指導(dǎo)依據(jù),也是抗酸桿菌檢測和FQ-PCR技術(shù)檢測所無法替代的,但是其耗時(shí)較長,因此,還需對其進(jìn)行改進(jìn)。采用FQ-PCR技術(shù)檢測,雖然偶爾也會出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果,但是其檢測過程簡便快捷,并且準(zhǔn)確率較高,臨床診斷人員也可將FQ-PCR技術(shù)與結(jié)核桿菌培養(yǎng)檢測、抗酸桿菌檢測等進(jìn)行聯(lián)合起來使用,在提高診斷準(zhǔn)確率的同時(shí),為肺結(jié)核疾病的診斷和治療提供準(zhǔn)確的指導(dǎo)依據(jù)。