馬妍，吳丹，張偉，梁嘉鈺，李斌（.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 30050；.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 3067）

目前，中風(fēng)已成為成人致殘的首要原因，是僅次于冠心病的全球第二大致死原因，其中缺血性卒中約占80%[1]。中醫(yī)藥對缺血性中風(fēng)的治療效果肯定[2]，腦心通膠囊作為上市多年的中成藥，由黃芪、赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎、桃仁、紅花、乳香（制）、沒藥（制）、雞血藤、牛膝、桂枝、桑枝、地龍、全蝎、水蛭等16 味藥組成，其可益氣活血、化瘀通絡(luò)，用于氣虛血瘀、脈絡(luò)瘀阻所致中風(fēng)、冠心病等。腦心通具有抑制炎癥因子釋放、抗氧化及凋亡、神經(jīng)保護(hù)等作用[3]，關(guān)于腦心通膠囊治療中風(fēng)方面研究目前集中在臨床和動物方面，其體外及深入機(jī)制研究較少。

腦缺血后神經(jīng)損傷的機(jī)制，除神經(jīng)元缺血缺氧后Na＋-K＋-ATP 酶活性降低，細(xì)胞去極化，釋放興奮性氨基酸，引發(fā)興奮性氨基酸受體介導(dǎo)的Na＋和Ca2＋內(nèi)流外，非谷氨酸機(jī)制在腦缺血后離子失衡及細(xì)胞死亡中也起到了相當(dāng)重要的作用[4]，如瞬時受體電位通道（TRP）[5-6]、酸敏感離子通道（ASICs）[7]等。其中TRPM 是一種非特異性陽離子通道，其成員TRPM2 和TRPM7 在腦缺血過程中與Ca2＋失衡導(dǎo)致的細(xì)胞損傷甚至細(xì)胞死亡關(guān)系密切[8]。隨著缺氧時間延長，谷氨酸釋放造成的Ca2＋濃度升高不再是主要原因，而TRPM7 成為Ca2＋內(nèi)流的主要通道，其開放與一氧化氮（NO）介導(dǎo)的活性氧（ROS）大量生成有關(guān)[9]。

基于以上研究現(xiàn)狀，本研究以原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元為研究對象，建立氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）損傷模型，由于中藥復(fù)方用于離體實驗存在諸多問題，本研究采用腦脊液藥理學(xué)的給藥方法，觀察腦心通的神經(jīng)保護(hù)作用以及對TRPM7的影響，以期為腦心通治療缺血性腦卒中提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

Wistar 大鼠，體質(zhì)量（180±20）g [天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，SCXK（津）2009-0004]；大耳白家兔，體質(zhì)量（2±0.2）kg [天津市工程所實驗動物中心，SCXK（津）2010-0002]。

1.2 試藥

DMEM/F12 培養(yǎng)基、DMEM 無糖培養(yǎng)基、B-27、胰酶（不含EDTA）、D-hank’s 溶液（美國Gibco）；胎牛血清、青霉素/鏈霉素、PBS 溶液（美國Hyclone）；DAPI 溶液（即用型）、多聚賴氨酸（索來寶）；微管相關(guān)蛋白2（MAP2）-抗（兔源）、Anti-rabbit IgG（H ＋L）、F（ab）2Fragment（Alexa Fluor.488Conjugate）（美國CST）；Triton X-100、DSMO（美國Sigma）；CCK-8 檢測試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；LDH 檢測試劑盒（南京建成公司）；Trizol（美國Invitrogen）；反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA 合成試劑盒、FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche）；腦心通膠囊超微粉（陜西步長集團(tuán)，用超純水配制成質(zhì)量濃度為0.262 g·mL－1的溶液備用）。TRPM7 的PCR引物委托上海生工生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成，引物序列（Forward primer：5’-CAGAGCACGATGTCCTGAGA-3’；Reverse primer：5’-GCAAATGTGAGCTTCTGTGC-3’）。

2 方法

2.1 神經(jīng)元原代培養(yǎng)

將懷孕16 ～17 d 的Wistar 孕鼠脫臼處死，無菌條件下剪開腹腔分離串珠狀子宮，取出胎鼠、分離胚胎大腦，剔除軟腦膜及大血管，得到胚胎大腦皮層。將其剪成約1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，加入0.25%的胰蛋白酶37 ℃消化、溫和吹打、過濾，濾液800 r·min－1離心，棄上清，將細(xì)胞用含10% FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106·mL－1，接種于預(yù)先包被0.01%多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中。接種4 h 后置換為無血清DMEM/F12 完全培養(yǎng)基（含2% B-27，0.5%雙抗）。隔一日半量換液一次。7 d 后用于實驗。

2.2 原代神經(jīng)元鑒定[MAP2 免疫熒光染色]

將原代培養(yǎng)的胎鼠大腦皮層神經(jīng)元（cortical neuron cell，CNC）以1×106·mL－1密度接種于24 孔板中7 d，每孔加入 4%的多聚甲醛固定、晾干后置于－20℃冰箱備用。實驗時每孔加入0.5% Triton-100 15 min 后加入以1∶50 比例稀釋的MAP2 一抗（兔源）。4 ℃冰箱中12 h 過夜。加入1∶1000 比例稀釋的熒光二抗（抗兔），37℃避光孵育后加入DAPI 工作液，室溫避光孵育10 min 后，置于熒光倒置顯微鏡下觀察拍片。

2.3 腦心通含藥腦脊液（BNC）的制備

將大耳白家兔隨機(jī)分為腦心通組及空白組，按照人與家兔劑量換算后的給藥劑量[0.262 g/（kg·d）]，予腦心通組家兔以腦心通膠囊超微粉水溶液灌胃，每日一次，連續(xù)3 d?？瞻捉M不予特殊處理。于腦心通組最后一次灌胃2 h 后采集兩組家兔腦脊液：將家兔耳緣靜脈注射空氣處死，取側(cè)臥位置于手術(shù)臺，充分暴露出枕骨大孔。清除毛發(fā)，暴露頸部皮膚，酒精消毒后剪開皮膚，鈍性分離肌肉組織，將1 mL 注射器適量地抽取負(fù)壓，于枕骨粗隆下約1 cm 處進(jìn)針，向家兔鼻尖的方向緩慢刺入。當(dāng)見到無色透明的液體流入注射器時固定針頭，緩慢抽取腦脊液。將抽取的腦脊液匯集注入離心管內(nèi)，3000 r·min－1離心15 min，過濾除菌，分裝，置于－80℃冰箱內(nèi)凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 分組及處理

CNC 以1×106個·mL－1密度接種于96 孔板，將其隨機(jī)分為正常組、空白腦脊液組、不同劑量腦心通含藥腦脊液組。

實驗前正常組置換為DMEM/F12 培養(yǎng)基；空白腦脊液組置換為含20%空白腦脊液的DMEM/F12 培養(yǎng)基；腦心通含藥腦脊液各組置換為含有不同劑量腦心通腦脊液的DMEM/F12 培養(yǎng)基，根據(jù)參考文獻(xiàn)[10-11]分別設(shè)置劑量梯度為2.5%、5%、10%、15%、20%；為排除空白腦脊液的影響，用空白腦脊液將腦心通含藥腦脊液各組補足至每組腦脊液總百分比均為20%（即2.5%腦心通含藥腦脊液組培養(yǎng)基中含有17.5%空白腦脊液、5%腦心通含藥腦脊液組培養(yǎng)基中含15%空白腦脊液，以此類推），各組均培養(yǎng)6 h。

RT-PCR 實驗中取以1×106個·mL－1密度接種于6 孔板的CNC，分為正常組、模型組、不同劑量腦心通含藥腦脊液組。正常組及模型組培養(yǎng)基中均含有20%空白腦脊液以排除干擾，不同劑量腦心通含藥腦脊液各組均以空白腦脊液補足。

2.5 神經(jīng)元OGD/R 模型的建立

CNC 以1×106個·mL－1密度接種，以氧糖剝奪12 h/復(fù)氧4 h、氧糖剝奪9 h/復(fù)氧3 h、氧糖剝奪6 h/復(fù)氧2 h、氧糖剝奪4 h/復(fù)氧2 h 四種不同氧糖剝奪/復(fù)氧時間進(jìn)行實驗，另設(shè)正常組，每組設(shè)8 個平行孔。正常組：開始實驗后將培養(yǎng)基置換為加葡萄糖（4500 mg·L－1）的無糖DMEM 培基，按照不同OGD/R 總時長分別繼續(xù)培養(yǎng)16、12、8、6 h；OGD/R 組：開始實驗后將培養(yǎng)基置換為用1 mmol·L－1HCl 調(diào)節(jié)成pH 值為6.4 ～6.8 的無糖DMEM 酸性培基，將培養(yǎng)板放入缺氧小室中進(jìn)行不同時長的缺氧。氧糖剝奪結(jié)束后取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)基置換為加葡萄糖的無糖DMEM 培基，于CO2培養(yǎng)箱以不同時長復(fù)氧孵育。

2.6 CCK-8 法檢測CNC 細(xì)胞活力

每孔加入CCK-8 與DMEM/F12 混合液（比例為1∶10）100 μL，避光孵育2 h，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定吸光度值。

2.7 LDH 試劑盒檢測CNC 細(xì)胞膜損傷情況

留取氧糖剝奪和復(fù)氧后的細(xì)胞培養(yǎng)液混合，按照LDH 試劑盒說明書操作。每孔依次加入氧化型輔酶I、2，4-二硝基苯肼、0.4 mol·mL－1NaOH 溶液等試劑，于酶標(biāo)儀450 nm 波長處測定吸光度值。

2.8 RT-PCR 法檢測TRPM7 mRNA 的表達(dá)水平

將CNC 按“2.3”“2.4”項下方法處理后加入Trizol，反復(fù)吹打至細(xì)胞全部脫落、破裂，提取細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度法檢測RNA 樣品的濃度及純度，后按照試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，制備反應(yīng)體系，應(yīng)用實時定量PCR 儀分析，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析。

2.9 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析方法，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。方差不齊時用Tamhanes’s h2 統(tǒng)計方法。

3 結(jié)果

3.1 CNC 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

倒置相差顯微鏡下觀察CNC 的形態(tài)，接種后4 h 初貼壁時，已有部分CNC 長出細(xì)小突觸；1 d 后，CNC 立體感增強(qiáng)，周邊有光暈，大部分CNC 長出突起；3 d 時，CNC 胞體增大，以多級CNC 為主，連結(jié)成稀疏的網(wǎng)絡(luò)；5 d 時，CNC 胞體明顯增大，突起增粗、增長，交結(jié)成網(wǎng)；7 d 時，CNC 有明顯立體感，分支連接成網(wǎng)，胞體增大，部分聚集成團(tuán)（見圖1）。當(dāng)CNC 受到OGD/R 損傷后，胞體皺縮，胞漿呈空泡狀，輪廓模糊，突起損傷，出現(xiàn)溶解現(xiàn)象（見圖2A）。

圖1 神經(jīng)元培養(yǎng)不同時間的生長情況（200×）Fig 1 Growth of CNC cultured for different time（200×）

3.2 MAP2 免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元

MAP2 是組成神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要組成成分，是神經(jīng)元軸突的標(biāo)志物，MAP2 免疫熒光染色后，可見90%以上細(xì)胞胞漿呈陽性（見圖2B）。結(jié)果表明該實驗方法獲得的細(xì)胞為神經(jīng)元，純度符合實驗要求。

圖2 神經(jīng)元缺氧9 h/復(fù)氧3 h 損傷后的情況（A）及神經(jīng)元MAP2免疫熒光染色（B）（200×）Fig 2 CNC injured after 9 h hypoxia and 3 h reoxygenation（A），and the immunofluorescence staining of MAP2 of CNC（B）（200×）

3.3 腦心通含藥腦脊液對正常培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞活力、LDH 釋放量的影響

10%腦心通含藥腦脊液可顯著提高正常培養(yǎng)CNC 的細(xì)胞活力（P＜0.05），其他各組有提高CNC 細(xì)胞活力的趨勢（見圖3A）；各劑量腦心通含藥腦脊液對CNC 的LDH 釋放量無明顯影響（見圖3B）。以上說明腦心通含藥腦脊液對正常培養(yǎng)的CNC 無明顯損傷作用，10%腦心通含藥腦脊液可提高正常培養(yǎng)CNC 的細(xì)胞活力。

圖3 腦心通含藥腦脊液對正常培養(yǎng)CNC 細(xì)胞活力（A）及LDH 含量（B）的影響Fig 3 Effect of BNC on cell activity（A）and content of LDH（B）of normal cultured CNC

3.4 神經(jīng)元OGD/R 模型的建立

如圖4所示，OGD/R 各實驗組CNC 的細(xì)胞活力均明顯降低（P＜0.01），其中氧糖剝奪時間是決定細(xì)胞損傷程度的關(guān)鍵。根據(jù)OGD/R 后CNC 損傷程度，確定OGD/R 模型條件為氧糖剝奪4 h/復(fù)氧2 h。

圖4 不同氧糖剝奪、復(fù)氧時間對CNC 細(xì)胞活力的影響Fig 4 Effect of different oxygen-glucose deprivation and reoxygenation time on the viability of CNC cells

3.5 腦心通含藥腦脊液對神經(jīng)元OGD/R 損傷后細(xì)胞活力、LDH 釋放量的影響

與正常組相比，OGD/R 組CNC 細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01）（見圖5A），LDH 釋放量明顯增加（P＜0.01）（見圖5B）；各劑量腦心通含藥腦脊液均可明顯提高神經(jīng)元OGD/R 損傷后的細(xì)胞活力（P＜0.01）（見圖5A），5%～20%腦心通含藥腦脊液可明顯降低神經(jīng)元OGD/R 損傷后LDH 的釋放量（P＜0.05，P＜0.01）（見圖5B）?？梢娔X心通含藥腦脊液具有抗神經(jīng)元OGD/R 損傷的作用。

圖5 不同劑量腦心通含藥腦脊液對神經(jīng)元OGD/R 損傷后細(xì)胞活力（A）及LDH 釋放量（B）的影響Fig 5 Effect of different doses of BNC on cell viability（A）and LDH release（B）of CNC after OGD/R injury

3.6 腦心通含藥腦脊液對神經(jīng)元OGD/R 損傷后TRPM7 mRNA 表達(dá)的影響

綜合以上實驗結(jié)果，確定了神經(jīng)元OGD/R 模型條件為氧糖剝奪4 h/復(fù)氧2 h，選取本實驗的腦心通含藥腦脊液給藥低、中、高劑量（分別為2.5%、5%和10%）。如圖6所示，神經(jīng)元OGD/R 損傷后，OGD/R 組神經(jīng)元內(nèi)TRPM7 mRNA 的表達(dá)水平較對照組明顯升高（P＜0.01）；腦心通含藥腦脊液各組均可明顯降低神經(jīng)元OGD/R 損傷后TRPM7 的mRNA 的表達(dá)水平（P＜0.05，P＜0.01）。

圖6 腦心通含藥腦脊液對神經(jīng)元OGD/R 損傷后TRPM7 mRNA 表達(dá)的影響Fig 6 Effect of BNC on TRPM7 mRNA expression after OGD/R injury in CNC

4 討論

原代培養(yǎng)神經(jīng)元在體外實驗中具有優(yōu)勢[12]。OGD/R 模型是較接近體內(nèi)情況的一種實驗?zāi)Ｐ蚚13-14]，可更好地模擬腦缺血再灌注的體內(nèi)變化情況。腦脊液藥理學(xué)方法具有避免血清對神經(jīng)元的毒害作用、解決藥物通過血腦屏障問題等優(yōu)勢[15-17]。

腦缺血可導(dǎo)致ATP 生成減少、離子泵紊亂、離子失衡、谷氨酸釋放、神經(jīng)元內(nèi)鈣超載，進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等一系列瀑布樣病理變化，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡和死亡[18]。谷氨酸受體依賴和非谷氨酸受體依賴的途徑均可導(dǎo)致鈣超載[19]，既往對谷氨酸依賴性鈣超載途徑研究占據(jù)主要地位[20]，然而谷氨酸受體阻斷劑在臨床中的應(yīng)用并不理想[21]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，OGD 時間延長至1.5 h 時，谷氨酸受體阻斷劑已不能發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，細(xì)胞死亡的原因主要是由于通過非特異性的陽離子通道導(dǎo)致的鈣超載，其在腦缺血后離子失衡及細(xì)胞死亡中也發(fā)揮著相當(dāng)重要的作用[20，22-23]。目前發(fā)現(xiàn)的非谷氨酸受體依賴鈣超載的機(jī)制主要包括ASICs[6]、TRP[5]、ATP 敏感性鉀通道（KATP）[24]、半通道[25]等。

TRP 通道家族是一大類非特異性陽離子通道的集合，其中TRPM 是其一類亞族，TRPM2 和TRPM7 與腦缺血遲發(fā)性的鈣超載密切相關(guān)[20]。TRPM7 在缺血缺氧時腦損傷和神經(jīng)元細(xì)胞死亡中起關(guān)鍵作用[26]。用SiRNA 抑制 TRPM7 的表達(dá)，可以明顯抑制OGD 3 h 以上的Ca2＋內(nèi)流[5]，并阻止ROS 介導(dǎo)的一系列反應(yīng)。目前，最有效和特異的TRPM7 抑制劑是waixenicin A，可減輕腦缺血缺氧損傷，TRPM7 是一種新興的藥物靶點[26]。本研究發(fā)現(xiàn)腦心通通過抑制非谷氨酸受體依賴途徑中的TRPM7 表達(dá)從而減輕神經(jīng)元OGD/R 損傷。為腦心通治療缺血性腦卒中提供了實驗依據(jù)和初步探索方向。