■鄭 智 王垂瑾 王 堯 高煜杰

(海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南?？?570228)

二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)是動物體內(nèi)具有重要生理功能的n-3系長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，參與動物體細胞膜物質(zhì)運輸、基因表達調(diào)控和滲透壓調(diào)節(jié)等重要生理過程[1-2]。然而大多數(shù)海洋性魚類合成LC-PUFA的能力有限[3]，因此飼料中需要添加足量LC-PUFA以滿足其對此類必需脂肪酸的需求。當(dāng)飼料中必需脂肪酸缺乏時會嚴重損害魚體肝臟正常生理機能、破壞細胞膜完整性、引起轉(zhuǎn)氨酶等指標(biāo)升高，甚至出現(xiàn)脂肪肝癥狀[4-5]。此外，研究還表明飼料中DHA/EPA比例也會影響魚體正常生長，且適宜DHA/EPA比例有助于提高魚體脂肪代謝能力和免疫性能，從而維持機體健康[6]。但研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬魚類對飼料中最適DHA/EPA比例要求存在較大差異。對斜帶石斑魚中的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中DHA/EPA比例為1或2時，魚體生長及健康達到最佳狀態(tài)[7]。而對點帶石斑魚（Epinephelus mala?baricus）的研究發(fā)現(xiàn)DHA是其較適宜的LC-PUFA類型，當(dāng)DHA/EPA比例為3∶1時，魚體生長得到顯著提高[8]。

虎龍斑（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）是由鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatu）和棕點石斑魚（Epinephelus fuscoguttatus）雜交而來，不僅具有“虎斑頭、龍膽尾”的體型，且具備父本生長速度快、母本抗病能力強的優(yōu)勢，目前逐步成為石斑魚養(yǎng)殖的主要品種，具有較大發(fā)展?jié)摿9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，虎龍斑飼料中脂肪最適添加水平為7%～14%[10-11]，但有關(guān)虎龍斑多不飽和脂肪酸營養(yǎng)需求特點的研究仍十分匱乏，且不同魚類對LC-PUFA需求特點（如最適DHA/EPA比例）存在較大差異。因此，本文擬通過養(yǎng)殖實驗探究飼料中最適DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚生長的影響，同時通過分析肌肉脂肪酸組成、肝臟脂肪沉積以及脂肪代謝基因表達情況，研究DHA/EPA比例對魚體生理生化的影響，以期為虎龍斑脂類營養(yǎng)提供理論依據(jù)，對飼料中脂類選擇及添加提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

實驗設(shè)計6種等氮（53%）、等脂（7%）飼料，通過添加不同水平DHA和EPA純化油（陜西冠晨生物有限公司）以設(shè)置6組DHA/EPA比例梯度，即0.54、0.97、1.51、2.01、2.41和2.85。實驗飼料配方及營養(yǎng)水平見表1，飼料脂肪酸組成（干重）見表2。實驗飼料制作時，將所有原料進行粉碎，逐一準(zhǔn)確稱量，放入攪拌機中混合30 min，隨后加入豆油和純化油脂并不斷攪拌，最后加入一定量蒸餾水，攪拌均勻后用雙螺桿擠壓機（華南理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，廣州）制成3 mm粒徑顆粒，并于室內(nèi)風(fēng)干，-20℃貯藏備用。

表1 實驗飼料配方及營養(yǎng)水平

表2 實驗飼料脂肪酸組成(%)

1.2 實驗魚苗及養(yǎng)殖過程

實驗所用虎龍斑幼魚購自海南省?？谑泄鹆盅笠挥鐖觥ｔ~苗運輸至室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)后用自制飼料馴化1周。隨后隨機挑選216尾規(guī)格均一[(20.8±0.03)g]、健康個體分配至18個玻璃缸（60 cm×45 cm×50 cm）中，每種飼料設(shè)置3個平行。每日飽食投喂2次（8：00和16：30）。實驗期間海水鹽度為30 g/L，水溫（29±0.5）℃，溶解氧（5.9±0.1）mg/L，氨氮0～0.20 mg/L，養(yǎng)殖周期為42 d。

1.3 樣品采集

42 d養(yǎng)殖實驗結(jié)束時實驗魚饑餓24 h后開始取樣，取樣前對每缸實驗魚進行計數(shù)和稱重。每缸取5尾魚用MS222進行麻醉，取其中2尾魚置于-20℃用于全魚組織成分分析；3尾魚解剖后收集肌肉組織用于常規(guī)組分和脂肪酸含量分析，取肝臟中間部分（1 cm3）置于液氮中用于油紅冷凍切片分析，肝臟其余部位置于液氮中用于后續(xù)RNA提取及熒光定量PCR檢測。

1.4 指標(biāo)測定及方法

1.4.1 生長性能計算

增重率（WGR，%）=100×（Wt-W0）/W0

特定生長率（SGR，%/d）=100×（lnWt-lnW0）/t

飼料系數(shù)（FCR）=攝食量/增重

成活率（SR，%）=100×（實驗?zāi)~尾數(shù)/實驗初魚尾數(shù)）

式中：t——實驗天數(shù)（d）；

Wt——實驗結(jié)束時平均體重（g）；

W0——實驗開始時平均體重（g）。

1.4.2 肌肉脂肪酸測定

取50 mg肌肉組織樣品，加入1 mL 0.37 mol/L氯化鉀溶液勻漿后加入4 mL Folch液（氯仿∶甲醇=2∶1）斡旋混勻，加入500μL Folch液使其溶解，轉(zhuǎn)入10 mL棕色甲酯化玻璃瓶，并加入500μL、1 mg/mL十九烷酸（溶于正己烷，上海安譜實驗科技股份有限公司），氮吹干燥后加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液（GC級，Sigma，美國），在水浴鍋中100℃水浴30 min，冷卻至室溫，加入2 mL甲醇（GC級，Sigma，美國），100℃水浴20 min，冷卻至室溫將液體轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入1 mL正己烷（GC級，Sigma，美國）和1 mL蒸餾水，斡旋混勻后2 000 r/min離心5 min，吸取1 mL上清移至上樣瓶中。氣象色譜儀（安捷倫6890N，美國）：色譜柱柱溫為140℃保持5 min，以4℃/min速度升溫至240℃后保持30 min，進樣量1μL，脂肪酸成分的計算用峰面積歸一化法。

1.4.3 肝臟油紅染色切片

肝臟組織在冷凍切片機(CRYOSTAR NX50，Ther?mo，上海)中切片，用10%福爾馬林固定，蒸餾水沖洗后60%異丙醇浸泡；油紅溶液染色后60%異丙醇溶液沖洗切片，蒸餾水潤洗后進行光學(xué)顯微鏡觀察(奧林巴斯，IX71)。采集圖像后用Image-Pro Plus 6.0軟件對油紅染色區(qū)域中脂滴區(qū)域進行統(tǒng)計計算。

1.4.4 肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達分析

利用Trizol試劑法（Invitrogen，美國）提取肝臟總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗RNA完整性，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Master Mix，TaKaRa，日本）說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。在熒光定量PCR儀（Quant?Studio 6 Flex，Applied Biosystems，新加坡）上進行實時熒光定量PCR測定，該實驗反應(yīng)總體系為10μL，包括5μL TB Green Premix Ex Taq（TaKaRa，日本），各0.2μL正反引物（10μmol/L），4.1μL無核酶DEPC水和0.5μL cDNA。Q-PCR反應(yīng)程序如下：95℃、10 min，95℃、15 s，56℃、60 s，40個循環(huán)；70℃、20 s。引物序列根據(jù)本實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫獲得并通過測序驗證（見表3），擴增效率為E=10（-1/slope）-1，目的基因表達為2-△△Ct。

表3 實時熒光定量PCR基因引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)用”平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和Tukey’s多重檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚生長及飼料利用的影響（見表4）

表4 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚生長及飼料利用的影響

如表4所示，42 d養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，虎龍斑幼魚生長及飼料利用并未受到飼料中DHA/EPA比例的影響（P>0.05）。當(dāng)DHA/EPA比例為0.54時魚體增重率和特定生長率最低，而最高組出現(xiàn)在DHA/EPA比例為1.51時。同樣，飼料系數(shù)及成活率在各實驗組間也無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚肌肉脂肪酸組成的影響（見表5）

表5 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚肌肉脂肪酸組成的影響（%）

由表5可知，飼料DHA/EPA比例影響虎龍斑幼魚肌肉脂肪酸組成，其中飽和脂肪酸含量隨著DHA/EPA比例升高而總體呈現(xiàn)下降趨勢，而Σn-6 PUFA則總體呈現(xiàn)上升的趨勢。實驗魚DHA/EPA比例與飼料中DHA/EPA比例呈現(xiàn)正相關(guān)，其比例隨飼料中DHA/EPA比例升高而升高。

2.3 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚肝臟脂肪沉積的影響（見圖1）

如圖1油紅染色切片所示，飼料DHA/EPA比例影響虎龍斑幼魚肝臟脂肪沉積。由圖1（g）可知，攝食較低DHA/EPA比例（0.54、0.97）飼料的實驗組魚體肝臟脂滴沉積顯著高于其他各實驗組（P<0.05），而DHA/EPA比例由1.51升高到2.85時，并未對肝臟脂滴沉積產(chǎn)生顯著影響（P>0.05）。

圖1 攝食不同DHA/EPA比例飼料虎龍斑幼魚肝臟油紅染色切片[目鏡10×，物鏡40×，脂滴：紅色，細胞核：藍色)，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(n=6)表示]

2.4 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響（見圖2）

如圖2所示，脂肪合成代謝相關(guān)基因FAS和ACC受飼料DHA/EPA比例影響。其中較低比例（0.54、0.97）實驗組魚體肝臟FAS基因表達量顯著高于1.51、2.01和2.85實驗組（P<0.05）；同樣，較低比例（0.54、0.97）實驗組魚體肝臟ACC基因表達量顯著高于其他各實驗組（P<0.05），而2.41實驗組ACC基因表達量最低，顯著低于除2.85實驗組外的其他各實驗組（P<0.05）。SREBP1和CPT1α基因在各實驗組魚體肝臟中表達差異不顯著（P>0.05）。PPARα基因表達量在較低DHA/EPA比例（0.54、0.97）實驗組顯著下調(diào)（P<0.05），而DHA/EPA比例1.51～2.85實驗組間差異不顯著（P>0.05）。飼料DHA/EPA比例為1.51和2.01實驗組虎龍斑幼魚肝臟HSL基因表達量顯著高于其他各實驗組（P<0.05），而DHA/EPA比例為0.54實驗組魚體肝臟HSL基因表達最低，且與除0.97實驗組外的其他各實驗組間有顯著性差異（P<0.05）。

圖2 飼料不同DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚肝臟脂肪合成(a)與分解(b)相關(guān)基因表達的影響

3 討論

3.1 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚生長性能的影響

海水肉食性魚類生長所需n-3 PUFA通常由食物攝入，且適宜水平DHA和EPA對于維持魚體生長及正常生理功能至關(guān)重要[12]。本實驗結(jié)果表明，飼料中最低DHA/EPA比例(0.54)實驗組虎龍斑幼魚增重率最低，但各組間差異不顯著。同樣在軍曹魚(Rachycen?tron canadum)[13]和黑鯛(Acanthopagrus schlegelii)[14]研究結(jié)果中也顯示飼料DHA/EPA比例對魚體生長并未產(chǎn)生顯著影響。斜帶石斑魚中的研究顯示DHA/EPA比例為1或者2時，魚體生長最佳，優(yōu)于較低比例組[10]；而點帶石斑魚的研究表明，魚體生長隨著飼料DHA/EPA比例升高而不斷增加，比例為3.0時增重最高[11]。

3.2 飼料DHA/EPA比例對虎龍斑幼魚肌肉脂肪酸組成的影響

海水魚類是人類重要的多不飽和脂肪酸來源，而魚體肌肉脂肪酸組成通常受到飼料脂肪酸組成的影響[15]。本實驗結(jié)果顯示魚體肌肉脂肪酸中飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸較好地反映了飼料中這兩種脂肪酸的組成和含量，在斜帶石斑魚[16]和駝背鱸(Crom?ileptes altivelis)[17]的研究中也呈現(xiàn)出類似的實驗結(jié)果。然而魚體肌肉中n-6 PUFA含量要高于飼料中相應(yīng)脂肪酸量，同時肌肉n-3脂肪酸含量低于飼料中n-3 PUFA含量，其中亞油酸(LA)和亞麻酸(ALA)在肌肉中的含量比飼料中的高，表明此種脂肪酸在肌肉中得到了沉積和保留。不同實驗組肌肉中DHA和EPA含量變化趨勢與飼料中DHA和EPA添加水平密切相關(guān)，但肌肉中DHA和EPA含量均低于飼料中含量。有研究表明，EPA由于與線粒體中的β氧化過程密切相關(guān)，從而易于在肌肉中氧化分解，而飼料中DHA含量過高時也傾向于氧化供能[18]。與尖吻鱸(Lateo?labrax japonicus)[19]中的實驗結(jié)果類似，本實驗中魚體肌肉DHA/EPA比例也高于飼料中DHA/EPA比例。

3.3 飼料DHA/EPA比例對肝臟脂肪代謝相關(guān)基因表達的影響

肝臟是魚類脂質(zhì)代謝的重要器官，能夠維持動物體能量平衡，但異常的脂質(zhì)沉積會危害魚體健康[20]。雖然研究顯示DHA和EPA在動物體脂質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用[21]，但有關(guān)DHA/EPA比例對魚類脂質(zhì)代謝影響的研究仍然十分有限。實驗研究結(jié)果表明，攝食較低DHA/EPA比例（0.54和0.97）飼料魚體肝臟中脂質(zhì)積累顯著高于其他實驗組，這與在牙鲆（Platichthys stellatus）中的研究結(jié)果一致[22]；在黑鯛中的報道同樣發(fā)現(xiàn)攝食較低DHA/EPA比例飼料實驗魚體肝體比顯著高于其他實驗組[14]。然而在舌鰨（Lateolabrax japonicus）中的研究結(jié)果表明，適宜DHA/EPA比例增加了脂肪在肝臟中的沉積，但未對魚體生長和健康造成不利影響[19]。Shang等[23]研究表明DHA/EPA通過調(diào)節(jié)脂肪酸氧化及脂肪合成相關(guān)基因從而影響動物體內(nèi)脂質(zhì)積累。本實驗結(jié)果顯示，攝食較低DHA/EPA比例（0.54和0.97）飼料實驗魚肝臟脂肪合成關(guān)鍵酶FAS和ACC基因表達顯著上調(diào)，而脂肪分解相關(guān)基因PPARα顯著下調(diào)，同時HSL基因在攝食最低DHA/EPA比例（0.54）飼料實驗魚中顯著下調(diào)。在草魚的研究中也發(fā)現(xiàn)攝食較低DHA/EPA比例飼料時魚體肝臟PPARα基因表達量降低[24]。然而，在對黑鯛的研究中顯示，攝食較低DHA/EPA比例飼料實驗組（0.54和0.97）ACC基因表達下調(diào)。另外在舌鰨研究中顯示，飼料適宜水平DHA/EPA比例顯著上調(diào)ACC和FAS基因表達。以上研究結(jié)果表明對于虎龍斑幼魚而言，DHA含量較少時，抑制脂肪分解以及促進脂肪生成，DHA對于抑制肝臟脂肪過度沉積發(fā)揮著重要作用。

4 結(jié)論

本實驗條件下飼料DHA/EPA比例（0.54～2.85）對虎龍斑幼魚生長性能沒有顯著影響。但當(dāng)DHA/EPA比例較低時(0.54)，虎龍斑幼魚肝臟脂質(zhì)代謝(脂質(zhì)生成和脂質(zhì)分解)相關(guān)基因表達受到顯著影響，從而促進了脂肪在肝臟的沉積。