■于 航 王海默 鐘世勛 呂月琴 劉兆勝 孫汝江*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院，山東煙臺 264670；2.山東深海生物科技股份有限公司，山東煙臺 265500）

近年來，畜禽產(chǎn)品中抗生素的殘留問題受到越來越多的重視，此外，由于抗生素使用不當(dāng)，機(jī)體抵抗力也會下降，容易對細(xì)菌產(chǎn)生一定的耐藥性。目前，飼料端抗生素類添加劑的使用已經(jīng)全面禁止。如何通過在飼料中添加其他抗菌物質(zhì)來提高畜禽的抗病能力，便成為研究的熱點(diǎn)問題?？咕氖且环N由生物體自身編碼的多肽類物質(zhì)，具有廣譜抗菌活性，因其抗菌機(jī)理獨(dú)特、無耐藥性隱患且無殘留，已成為抗生素的良好替代品，在實(shí)際的畜牧生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。關(guān)于抗菌肽的研究已有許多，例如，抗菌肽在提高動物免疫能力和疾病防御能力等方面具有促進(jìn)作用[2-3]；抗菌肽可通過刺激黏液合成、促進(jìn)緊密連接蛋白的產(chǎn)生和腸屏障的修復(fù)，影響腸上皮屏障完整性的維持[4]。一些報道表明，抗菌肽有與抗生素所不同的作用機(jī)制，相比于抗生素通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)和DNA的合成等來達(dá)到抑菌的作用[5]，抗菌肽主要通過與細(xì)菌細(xì)胞膜作用來達(dá)到抑菌的目的，不易產(chǎn)生耐藥性[6]；此外，抗菌肽還可通過調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)或作為趨化因子招募其他效應(yīng)細(xì)胞來發(fā)揮作用[7]。本試驗(yàn)測定了抗菌肽APSH-07對常見致病菌的抑菌活性，以及與常用抗生素體外聯(lián)合使用的協(xié)同殺菌效應(yīng)，并探究抗菌肽APSH-07成為新型飼料添加劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌CICC21482、金黃色葡萄球菌ATCC6538P、哈維氏弧菌ATCCC BAA-1117、副溶血弧菌ATCC17802，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。試驗(yàn)菌株均保存于含20%甘油的冷凍管中，置于-80℃冰箱中。

1.1.2 主要試劑

阿莫西林（amoxicillin，純度>98%），土霉素（oxy?tetracycline，純度>98%），硫酸慶大霉素（gentamicin sulphate，純度≥590 U/mg），硫酸新霉素（neomycin sul?fate，純度99%），鹽酸強(qiáng)力霉素（doxycycline hyclate，純度>98%），均購自上海泰坦科技股份有限公司，保存于4℃冰箱中陰暗處；抗菌肽APSH-07，由山東深海生物科技股份有限公司提供，避光保存。

LB培養(yǎng)基粉末購自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。LB培養(yǎng)基配方見表1。

表1 LB培養(yǎng)基配方

依據(jù)試驗(yàn)需要，配置兩種培養(yǎng)基：

LB肉湯培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱量25 g LB粉末溶解于1 L蒸餾水，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃高壓滅菌20 min后，保存于4℃冰箱待用；

LB瓊脂培養(yǎng)基：準(zhǔn)確稱量25 g LB粉末和15 g瓊脂粉末溶解于1 L蒸餾水中，在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃高壓滅菌20 min后，保存于4℃冰箱待用。

1.2 制備菌懸液

將冷凍保存的菌株常溫下解凍，在LB瓊脂平板上接種劃線，于37℃恒溫箱中過夜培養(yǎng)。菌落形成后，挑選平板上的單個菌落接種至50 mL新鮮LB肉湯培養(yǎng)基中，隨后將肉湯置于37℃恒溫?fù)u床中，以170 r/min的速度震蕩12～18 h直至菌液渾濁。經(jīng)過稀釋，在分光光度計下測得OD600=0.5左右，即可作為試驗(yàn)菌液。

1.3 藥敏試驗(yàn)

1.3.1 最小抑菌濃度(MIC)的測定

將藥品取出，配成一系列濃度梯度的溶液。用滅菌的LB肉湯將抗菌肽APSH-07配置成1 280μg/mL的儲液，將抗生素配成320μg/mL的儲液。之后繼續(xù)用滅菌的LB肉湯將抗菌肽APSH-07的儲液進(jìn)行一系列雙倍稀釋，共得到1 280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5μg/mL等10個濃度梯度的APSH-07稀釋液；用滅菌LB肉湯將抗生素儲液進(jìn)行一系列雙倍稀釋，共得到320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μg/mL等10個濃度梯度的抗生素稀釋液。

向無菌96孔板的1～10孔依次加入90μL菌懸液，并相應(yīng)混合以10μL不同濃度的抗菌肽APSH-07或抗生素稀釋液。在第11孔加入100μL的菌懸液作為陽性對照，在第12孔加入100μL的LB肉湯培養(yǎng)基作為陰性對照。注意每次混合液體時要用移液槍吹打均勻。

液體添加完畢后，將96孔板置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察底部是否有細(xì)菌沉淀產(chǎn)生。無肉眼可見細(xì)菌沉淀的最小濃度即為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。每種藥物做3次重復(fù)。

1.3.2 最小殺菌濃度（MBC）的測定

取各藥物MIC、2×MIC、4×MIC濃度的內(nèi)容物各10μL，滴加至LB固態(tài)培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板，每個小孔做3次重復(fù)。待液體內(nèi)容物被完全吸收后，將平板轉(zhuǎn)移到37℃的恒溫培養(yǎng)箱中，倒置，培養(yǎng)18～24 h，觀察培養(yǎng)基上是否有菌落生長。無菌落生長的培養(yǎng)基對應(yīng)的最小濃度即為該種藥物的最小殺菌濃度（MBC）。

1.3.3 抗菌肽APSH-07與抗生素的聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

以抗菌肽APSH-07和土霉素聯(lián)用為例：分別配置2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍MIC濃度的抗菌肽APSH-07與土霉素溶液。進(jìn)行6×6棋盤試驗(yàn)，土霉素以橫行方式，APSH-07以縱列方式，將5μL各自不同濃度的藥液加入96孔板中,每孔再加菌液90μL。由此，使得每一橫行孔中土霉素的濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍的MIC，同時每一橫行孔中APSH-07濃度不變；每一縱列孔中APSH-07的濃度依次為2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5倍的MIC，同時每一縱列孔中土霉素的濃度不變?；旌暇鶆蚝螅瑢?6孔板轉(zhuǎn)移到37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。做3次重復(fù)。

在實(shí)驗(yàn)室中，以部分抑菌濃度指數(shù)(fractional in?hibitory concentration index,FIC Index)作為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)效果的判斷依據(jù)：

FIC Index=MIC A’/MIC A+MICB’/MICB

式中：MICA和MICB——A、B藥物單獨(dú)用藥時的MIC值；

MICA’和MICB’——A、B兩藥聯(lián)用時各自的MIC值。

根據(jù)FIC Index的范圍可以判斷聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的效果：FIC Index≤0.5為協(xié)同效應(yīng)；0.52為頡頏作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽APSH-07和抗生素單獨(dú)使用的MIC與MBC值（見表2）

表2 抗菌肽APSH-07與抗生素對常見致病菌的MIC與MBC測定值

從表2中可看出，APSH-07對于四種菌的MIC與MBC均在4μg/mL以內(nèi)，有較強(qiáng)的抑制作用。其中，APSH-07對于革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，對于其他三種革蘭氏陰性菌抑制效果稍弱。五種抗生素對于除了副溶血弧菌的三種菌均有良好的抑制效果，其中鹽酸強(qiáng)力霉素對大腸桿菌和哈維氏弧菌的抑制作用最明顯；但對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制效果稍弱一些。此外，在副溶血弧菌的試驗(yàn)中，五種抗生素均未檢測到對其的抑制性。而操慶國等[8]通過試驗(yàn)證明了土霉素、新霉素等八種抗生素對副溶血弧菌的生長均產(chǎn)生抑制作用，這說明本試驗(yàn)的副溶血弧菌菌株可能對抗生素產(chǎn)生了耐藥性，但產(chǎn)生耐藥性的原因尚未可知。

2.2 抗菌肽APSH-07和抗生素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的結(jié)果（見表3～表7）

抗菌肽APSH-07分別與阿莫西林、土霉素、硫酸新霉素、硫酸慶大霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素聯(lián)用，對金黃色葡萄球菌ATCC6538P、大腸桿菌CICC21482、哈維氏弧菌ATCCC BAA-1117的體外協(xié)同抗菌試驗(yàn)結(jié)果如表3～表7。

表3 抗菌肽APSH-07與阿莫西林單用和聯(lián)用的作用效果

表4 抗菌肽APSH-07與土霉素單用和聯(lián)用的作用效果

表5 抗菌肽APSH-07與硫酸新霉素單用和聯(lián)用的作用效果

表7 抗菌肽APSH-07與鹽酸強(qiáng)力霉素單用和聯(lián)用的作用效果

表6 抗菌肽APSH-07與硫酸慶大霉素單用和聯(lián)用的作用效果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，抗菌肽APSH-07與阿莫西林聯(lián)用，對于哈維氏弧菌的抗菌效果最明顯；與硫酸新霉素聯(lián)用，對金黃色葡萄球菌ATCC6538P的抗菌效果最不好，但APSH-07與以上五種抗生素聯(lián)用的FIC值均小于1，大部分小于0.5，均未有頡頏作用發(fā)生。此外，協(xié)同作用時，抗菌肽APSH-07的MIC值僅為其單獨(dú)作用時的1/8～1/2，具有較為優(yōu)良的作用?？偟膩砜?，APSH-07與阿莫西林聯(lián)用時聯(lián)合抗菌效果最好，表現(xiàn)為協(xié)同作用，F(xiàn)IC指數(shù)均小于或等于0.5，二者的相互促進(jìn)作用更明顯。

3 討論

抗菌肽APSH-07是通過高效定向誘導(dǎo)植物乳桿菌表達(dá)的一種具有抗菌活性的小肽類物質(zhì)，由于其三維結(jié)構(gòu)中存在穩(wěn)定的二硫鍵，故而性質(zhì)穩(wěn)定，對高溫以及酸、堿、蛋白酶等具有良好的耐受性，可在動物體內(nèi)正常發(fā)揮功能而不輕易失活。這種抗菌肽作為乳酸桿菌代謝過程產(chǎn)物，可以抑制脂多糖刺激產(chǎn)生的炎性因子mRNA的表達(dá)，同其發(fā)酵產(chǎn)物乳酸一起抑制LPS誘導(dǎo)的相關(guān)蛋白的活性，進(jìn)而起到抑菌防腐、減輕腸道炎癥、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收等作用，但對腸道益生菌幾乎無影響。Ge等[4]在日糧中添加APSH-07，顯著提高了大黃魚肝臟的SOD、CAT活性；Chen等[9]也發(fā)現(xiàn)，適量的APSH-07可增強(qiáng)皺紋盤鮑的抗氧化作用，并顯著降低副溶血弧菌導(dǎo)致的死亡。

本試驗(yàn)將抗菌肽APSH-07與五種常用抗生素的抑菌活性進(jìn)行對比，并將APSH-07與抗生素聯(lián)用來測定協(xié)同抑菌效應(yīng)，結(jié)果表明，APSH-07和抗生素對常見的致病菌均有抑菌效果，并且聯(lián)合使用后效果比單獨(dú)使用要好。這說明當(dāng)抗菌肽和抗生素聯(lián)合抑菌時，他們可能結(jié)合了各自的作用機(jī)理，從而使細(xì)菌更有效地被抑制或殺滅，同時，也闡明了抗菌肽代替抗生素的可行性。

在抗菌肽與抗生素聯(lián)合使用方面，已有諸多研究。Wakabayashi等[10]的研究表明，抗菌肽LFcinB與二甲胺四環(huán)素聯(lián)用可增強(qiáng)對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。華蕊等[11]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬源抗菌肽PR-39與阿莫西林、土霉素、硫酸鏈霉素等聯(lián)用，具有不同程度的協(xié)同作用。王國棟[12]也發(fā)現(xiàn)抗菌肽PG-1與丁胺卡那霉素、四環(huán)素聯(lián)用對大腸桿菌的抑制有協(xié)同或相加作用。在畜禽疾病的治療過程中，可將抗菌肽和抗生素混合使用，在更好地提高用藥效果的同時，還可以預(yù)防并延遲抗生素耐藥性的發(fā)生。因此，抗生素與抗菌肽的聯(lián)用，可以作為畜牧生產(chǎn)中的一個發(fā)展方向。關(guān)于APSH-07具體的作用機(jī)制以及對動物可能產(chǎn)生的負(fù)面影響等問題，可在今后的試驗(yàn)中繼續(xù)研究并予以完善。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)證明，抗菌肽APSH-07對常見致病菌有一定的抑制作用，并和阿莫西林、土霉素、硫酸慶大霉素、硫酸新霉素、鹽酸強(qiáng)力霉素聯(lián)用有協(xié)同或部分協(xié)同作用，為實(shí)際應(yīng)用提供了方向，這體現(xiàn)了APSH-07替代抗生素類添加劑成為新型的飼料添加劑的潛力。