■安 琦 曹亞彬 牛彥波 吳皓瓊 原 韜

（黑龍江省科學院微生物研究所，黑龍江哈爾濱 150010）

仔豬胃腸道發(fā)育不完善，免疫力低，易發(fā)生腸道疾病，隨著我國全面禁止使用抗生素，部分小型養(yǎng)殖場仔豬因胃腸疾病病死率可達到20%～30%，對養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟效益產(chǎn)生嚴重影響[1-2]。應用科學手段預防仔豬腹瀉成為行業(yè)內(nèi)關(guān)注的焦點。中草藥在我國有廣泛悠久的應用歷史，飼料中添加適量的中草藥，能夠起到提高適口性、增強免疫力、提高增重等功效[3-4]。此外，中草藥的毒副作用低，未發(fā)現(xiàn)耐藥性和產(chǎn)品殘留方面的問題[5]。目前，中藥材利用率僅為30%～70%，中藥渣中除了含有粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、氨基酸和微量元素等營養(yǎng)成分外，還殘留有一定量的多糖、黃酮和皂苷等生物活性成分，可作為飼料添加劑[6-8]。研究表明，在養(yǎng)殖飼料中添加經(jīng)過發(fā)酵處理的中藥渣，不但可以增強畜禽的體質(zhì)狀況，還能夠起到其他添加劑所達不到的藥用功能，降低精飼料的用量，降低生產(chǎn)成本，提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟收入[9-12]。研究表明，日糧添加中草藥添加劑可顯著提高日增重、提高肌肉大理石紋評分、顯著降低失水率、增加肌肉粗脂肪含量[13]。研究表明，用發(fā)酵五味子藥渣添加劑飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)仔豬的腹瀉率和料重比降低，豬腸上皮內(nèi)杯狀細胞和淋巴細胞數(shù)量增多，仔豬的免疫功能有所提高[14-15]。

據(jù)統(tǒng)計，中藥制藥企業(yè)每年產(chǎn)生數(shù)以千萬噸的中藥藥渣，多數(shù)生產(chǎn)廠家將藥渣作為廢料垃圾處理，造成了資源的巨大浪費和環(huán)境污染問題。如何有效利用藥渣資源，避免藥渣因長期堆放引起的環(huán)境污染是一個全新的課題。本研究采用的藥渣來源于中藥雙黃連中主要原料——黃芩藥渣，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，主治上呼吸道感染、肺熱咳嗽、肺炎、痢疾等癥狀[16-17]。本研究利用植物乳桿菌對黃芩藥渣進行發(fā)酵，發(fā)酵后的藥渣用于仔豬飼喂試驗，觀察其對仔豬增重、腹瀉率、腸道微生物群落及免疫功能的影響。通過對黃芩藥渣進行二次利用，旨在減少環(huán)境污染和資源浪費，為開發(fā)新型中藥渣飼料添加劑提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物乳桿菌菌種為植物乳桿菌植物亞種(Lacto?bacillus plantarum)，分離自黃芩藥渣。保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC No.20963)。黃芩廢渣取自雙黃連生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的中藥廢渣，藥渣經(jīng)粉碎，過20目篩網(wǎng)，備用。

MRS培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g/L、酵母浸粉5.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、半胱氨酸0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、硫酸錳0.28 g/L、吐溫80 1.0 g/L、pH 6.2～6.4。

1.2 黃芩藥渣發(fā)酵

取斜面菌種，于平板上進行三區(qū)劃線，30℃倒置培養(yǎng)直至長出單菌落；單菌落接種于液體活化培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，時間24 h；將活化好的菌種接種于發(fā)酵罐中，控制溫度37～43℃，時間24～36 h，制備發(fā)酵液。菌液中植物乳桿菌的含量≥108CFU/mL。

粉碎后的藥渣加入物料總重量80%～100%的水，攪拌均勻；高壓滅菌，物料厚度≤30 cm，120℃滅菌30 min；藥渣粉降溫至35～37℃；向冷卻后的物料中加入植物乳桿菌菌液，接種量為5%，于密閉發(fā)酵罐中厭氧發(fā)酵72 h；發(fā)酵結(jié)束后測得pH為4.5，植物乳桿菌菌數(shù)≥108CFU/g，得到發(fā)酵藥渣，平行處理無乳酸菌發(fā)酵黃芩藥渣作為未發(fā)酵藥渣備用。

1.3 仔豬喂養(yǎng)試驗

選取大三元雜交健康無病的21日齡仔豬72頭，隨機分為3組，每組24頭，采食同種飼糧，試驗期為28 d，免疫和管理按豬場常規(guī)進行。試驗分為黃芩藥渣組、發(fā)酵藥渣組、對照組。對照組仔豬僅飼喂基礎日糧，試驗組仔豬在基礎日糧中分別添加黃芩藥渣和發(fā)酵黃芩藥渣，添加量為2 kg/t，基礎日糧組成及營養(yǎng)水平如表1所示。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平

1.4 斷奶仔豬日增重情況測定

試驗仔豬分別于0、14 d和28 d空腹12 h后進行稱重、記錄，以計算不同時期及全期仔豬的增重情況。對0～28 d仔豬腹瀉情況進行評定：觀察并記錄試驗期每頭仔豬每天的腹瀉情況。

腹瀉率（%）=試驗期腹瀉仔豬頭次/（試驗豬頭次×試驗天數(shù)）×100

1.5 斷奶仔豬盲腸微生物菌群的測定

試驗結(jié)束后，每組隨機選取仔豬5頭，打開腹腔，結(jié)扎盲腸兩端，切下盲腸。在無菌操作臺中，準確稱取盲腸內(nèi)容物1 g放于盛有99 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，充分振蕩，取稀釋液進行10倍稀釋，吸取0.1 mL稀釋液接種于選擇性培養(yǎng)基上。其中，大腸桿菌用伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)；乳酸菌用MRS培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數(shù)。

1.6 斷奶仔豬血清抗氧化指數(shù)的測定

試驗28 d，各試驗組隨機選取健康狀況良好、體重相近的仔豬5頭，空腹前腔靜脈采血30 mL，靜置，3 000 r/min離心10 min，離心后血清分裝于離心管中，-30℃保存待測?？寡趸笜说臏y定：采用黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、采用比色法測定谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）活性、采用硫代巴比妥酸法（TBA）測定丙二醛（MDA）含量，具體步驟按試劑盒說明書操作。

1.7 血清免疫指標的測定

試驗28 d，各試驗組隨機選取健康狀況良好、體重相近的仔豬5頭，空腹前腔靜脈采血30 mL，靜置，3 000 r/min離心10 min，離心后血清分裝于離心管中，-30℃保存待測。血清免疫指標IgA、IgG、IL-4采用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定。

1.8 藥理學毒性試驗

選取體重為18～22 g的ICR鼠60只，經(jīng)3 d適應性飼養(yǎng)后，隨機均分為3組（雌雄各半），黃芩藥渣、發(fā)酵藥渣和空白對照組，每組各20只；空白對照組灌胃生理鹽水，黃芩藥渣、發(fā)酵藥渣組將制備的制劑溶于水中灌服，黃芩藥渣、發(fā)酵藥渣的藥物添加量為0.1 g/mL，0.4 mL/次，每日3次，連續(xù)7 d。每日觀察試驗鼠的精神狀態(tài)、飲食情況，每日記錄發(fā)病死亡情況；對于死亡鼠進行剖檢觀察內(nèi)臟變化；對試驗鼠進行定期稱重；試驗結(jié)束，采集血液分離血清，測定AST、ALT。稱量ICR鼠體重，對其臟器指數(shù)進行測定，取ICR鼠心臟、脾臟、肝臟、腎臟、睪丸、卵巢，稱重，按照下式計算臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)（%）=臟器重/體重×100

1.9 長期毒性試驗

根據(jù)制備的發(fā)酵藥渣制劑，20、100 g/kg給1月齡ICR鼠連續(xù)灌胃給藥30 d，觀察動物的皮毛、膚色、攝食、活動、尿、便等有無異常。

1.10 數(shù)據(jù)處理與分析

所有采集數(shù)據(jù)采用Excel軟件進行前期處理，然后用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，LSD進行多重比較，結(jié)果采用“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 中藥發(fā)酵飼喂對比試驗

2.1.1 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬日增重及腹瀉率的影響（見表2）

表2 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬日增重和腹瀉率的影響

由表2可知，0～14 d平均日增重，黃芩藥渣組較對照組提高5.98%，無顯著性差異（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣比對照組顯著提高7.19%（P<0.05），較黃芩藥渣組提高1.14%，無顯著性差異（P>0.05）。15～28 d平均日增重，黃芩藥渣組較對照組提高6.44%（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組較對照組顯著提高45.62%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高36.80%（P<0.05）。0～28 d平均日增重，黃芩藥渣組比對照組提高6.15%（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組較對照組顯著提高29.38%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高21.88%（P<0.05）。0～28 d仔豬腹瀉率，各試驗組均顯著低于對照組（P<0.05），其中發(fā)酵藥渣組仔豬腹瀉率最低。

2.1.2 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響（見表3）

由表3可知，發(fā)酵黃芩藥渣組的大腸桿菌數(shù)量顯著低于對照組（P<0.05）；黃芩藥渣組大腸桿菌數(shù)量低于對照組但無顯著性差異（P>0.05）。發(fā)酵黃芩藥渣組的乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量顯著高于對照組（P<0.05），其中乳酸菌數(shù)量顯著高于黃芩藥渣組（P<0.05）。黃芩藥渣組乳酸菌和雙歧桿菌數(shù)量高于對照組，但差異不顯著（P>0.05）。

表3 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬盲腸微生物菌群的影響

2.1.3 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬抗氧化性能的影響（見表4）

表4 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬抗氧化性能的影響

由表4可知，斷奶仔豬血清中T-SOD含量黃芩藥渣組較對照組提高14.66%，無顯著性差異（P>0.05）；發(fā)酵藥渣組較對照組顯著提高了40.52%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高了22.56%（P<0.05）。

斷奶仔豬血清中GSH含量試驗組與對照組之間無顯著性差異（P>0.05）。斷奶仔豬血清中MDA含量黃芩藥渣組較對照組降低51.61%，無顯著性差異（P>0.05）；發(fā)酵藥渣組較對照組分別顯著降低62.97%（P<0.05），較黃芩藥渣組降低23.48%（P>0.05）。

2.1.4 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬免疫指標的影響（見表5）

由表5可知，仔豬血清中IgA含量發(fā)酵藥渣組高于對照組和黃芩藥渣組但無顯著性差異（P>0.05）。黃芩藥渣組IgG含量較對照組提高2.41%，差異不顯著（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組IgG含量較對照組顯著提高42.08%(P<0.05)，較黃芩藥渣組顯著提高38.74%（P<0.05）。IL-4含量黃芩藥渣組較對照組提高3.99%，差異不顯著（P>0.05）；發(fā)酵黃芩藥渣組較對照組顯著提高38.28%（P<0.05），較黃芩藥渣組顯著提高32.97%（P<0.05）。

表5 發(fā)酵藥渣添加劑對斷奶仔豬血清免疫指標的影響

2.2 藥理學毒性試驗

2.2.1 臨床癥狀與病理學觀察

結(jié)果顯示，對照組和試驗組的ICR鼠精神狀態(tài)、飲食欲、對外界反應能力未見明顯的異常，各組鼠均無發(fā)病和死亡。對對照組和試驗組的ICR鼠進行剖檢，眼觀未見內(nèi)臟器官有明顯的病理變化。

2.2.2 生長指標觀察

試驗結(jié)束，對ICR鼠稱量體重、臟器重，計算各臟器指數(shù)，分析見表6。

由表6可知，試驗組ICR鼠肝臟、心臟、腎臟、肺臟、脾臟指數(shù)與對照組之間無顯著性差異（P>0.05），均處于正常范圍。

表6 各臟器指數(shù)分析(%)

2.2.3 肝臟功能變化觀察（見表7）

表7 谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）測定結(jié)果

試驗結(jié)束后，采取血液分離血清，測定AST、ALT活性，結(jié)果見表7。

由表7可知，試驗組數(shù)據(jù)與對照組相比差異不顯著，都處于正常范圍內(nèi)，飼喂發(fā)酵藥渣和發(fā)酵中藥對ICR鼠的肝臟功能無顯著毒副作用。

2.3 長期毒性試驗

結(jié)果顯示，連續(xù)給ICR鼠灌胃30 d，動物的皮毛、膚色、攝食、活動、尿、便等均無異常；動物的血常規(guī)，肝、腎功能等血液生化指標和動物的主要臟器指數(shù)均在正常范圍，且正常動力無差異；病理組織學檢查表明，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、氣管、睪丸、卵巢等重要臟器無病理改變。停藥14 d后檢查以上各項指標均無明顯毒性反應，表明無蓄積毒性。

3 討論

研究表明，腸道微生物菌群在提供保護性腸道屏障，促進營養(yǎng)物質(zhì)消化和代謝，同時在提高免疫力方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18-20]。腸道微生物通過刺激腸道黏膜的正常發(fā)育，實現(xiàn)對斷奶仔豬腸道黏膜免疫的調(diào)節(jié)作用[8，21]。益生菌可通過與致病菌競爭腸道黏膜表面結(jié)合位點，定植于腸道內(nèi)，從而調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物菌群的平衡，預防仔豬腹瀉發(fā)生[22-24]。本研究利用益生菌發(fā)酵雙黃連藥渣作為飼料添加劑，發(fā)酵產(chǎn)物兼具中草藥和益生菌的雙重功效，具有酸香味道，更有利于仔豬采食；還能夠提高仔豬腸道消化酶活性，促進小腸消化和吸收，降低蛋白質(zhì)在大腸中的發(fā)酵，防止有害微生物的滋生，從而防止仔豬腹瀉。飼喂結(jié)果顯示，發(fā)酵黃芩藥渣組仔豬腸道中乳酸菌數(shù)量和雙歧桿菌數(shù)量分別可達4.16×108CFU/g和5.32×108CFU/g，顯著高于對照組，其大腸桿菌數(shù)量顯著低于對照組（P<0.05）。植物乳桿菌發(fā)酵黃芩廢渣之后，能夠?qū)⒌谝淮谓徇^程中未得到提取的成分和活性物質(zhì)最大限度地轉(zhuǎn)化釋放，通過生物代謝使活性組分轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)，進而提高其抗病能力。

此外，研究發(fā)現(xiàn)黃芩藥渣還能夠降低應激反應、提高機體抗病力及免疫應答能力。仔豬血清免疫結(jié)果顯示，血清中的IgG、IL-4水平較藥渣組和對照組均有顯著提高；與對照組相比較，發(fā)酵黃芩藥渣組IgG含量顯著提高42.08%（P<0.05），IL-4含量顯著提高38.28%（P<0.05）。長期毒性試驗顯示，長期飼喂發(fā)酵藥渣對小鼠各臟器無明顯毒副作用，表明發(fā)酵藥渣可作為飼料添加劑用于動物喂養(yǎng)。綜上所述，黃芩藥渣發(fā)酵后，能夠改善動物腸道健康，促進動物生長發(fā)育，增強免疫力，能夠在一定程度上填補飼料行業(yè)全面禁抗后預防仔豬腹瀉方面的空白。在今后的研究中，發(fā)酵中藥渣與動物腸道健康的互作機制值得進一步深入探究。

4 結(jié)論

經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的黃芩藥渣作為飼料添加劑，能夠有效降低仔豬的腹瀉率，提高仔豬增重，有助于提高仔豬免疫力，調(diào)節(jié)仔豬腸道微生物菌群，為新型中藥渣飼料添加劑的開發(fā)提供新的思路。