蔣曉玙，馬超，余凱，周安，朱國(guó)飛

（1.貴陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院生化工程系，貴州貴陽(yáng) 550081）（2.貴州理工學(xué)院食品藥品制造工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550003）

關(guān)鍵字：胡桃醌；脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶1（Pin1）；光譜學(xué)；計(jì)算模擬；定點(diǎn)突變

胡桃楸和核桃在我國(guó)資源豐富，很多部分均可食用，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。大量研究結(jié)果表明，其含有的有效成分胡桃醌（Julgone，又名5-羥基-1,4-萘醌，屬于萘醌類(lèi)化合物），不僅具有顯著的抗菌、止血功能，還具有較好的抗腫瘤功效，能有效地抑制胃癌，肝癌，卵巢癌，宮頸癌，肺癌，結(jié)腸癌等惡性腫瘤的增殖[1-3]。然而，胡桃醌的這種抗腫瘤作用的分子機(jī)制任然還不是很清楚。

脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶 1（peptidyl-prolyl cis-trans isomerase NIMA-interacting 1，Pin1）可以特異性調(diào)節(jié)磷酸化蛋白質(zhì)中絲氨酸或蘇氨酸-脯氨酸模體（pSer/Thr-Pro）從順式構(gòu)象轉(zhuǎn)為反式構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)該蛋白功能，影響一系列信號(hào)通路[4]。Pin1的底物蛋白在有絲分裂、轉(zhuǎn)錄、分化和DNA損傷應(yīng)答等各種生物功能起著重要的作用。尤其值得注意的是，Pin1在原癌基因信號(hào)通路中也起著關(guān)鍵的作用，并且在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌和甲狀腺癌等多種腫瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)，其表達(dá)量高低與腫瘤惡性程度成正相關(guān)，而抑制腫瘤細(xì)胞中 Pin1蛋白的活性能夠觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5,6]。盡管研究表明，胡桃醌可作為 Pin1小分子抑制劑，能有效抑制其活性，從而抑制腫瘤增殖，但是胡桃醌與Pin1具體作用機(jī)制還知之甚少[7]。

為了從分子水平上探究胡桃醌對(duì) Pin1的抑制機(jī)制，本研究采用最常用的光譜法結(jié)合計(jì)算模擬探究了胡桃醌與 Pin1的互作機(jī)理[8,9]。在本研究中，首先使用熒光光譜推斷出Pin1與胡桃醌的淬滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)以及熱力學(xué)參數(shù)等信息。其次，使用同步熒光光譜和圓二色譜探究胡桃醌對(duì) Pin1構(gòu)象的影響。再次，利用分子對(duì)接預(yù)測(cè)出潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并對(duì)潛在的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變，構(gòu)建了H59A，L61A，C113A，S114和S154A等多個(gè)突變體，然后通過(guò)突變體熒光滴定對(duì)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了驗(yàn)證。最后，采用分子動(dòng)力學(xué)模擬探究 Pin1與胡桃醌在體外隨時(shí)間變化的結(jié)合信息。申炳俊等探究了胡桃醌與人血清白蛋白的相互作用研究[3]，為從分子水平上了解胡桃醌在體內(nèi)可能的運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝、排泄等提供了信息。本研究將從分子水平上探究胡桃醌與Pin1的相互作用，為闡明胡桃醌的抗腫瘤作用提供參考，為擴(kuò)大胡桃醌的應(yīng)用，綜合開(kāi)發(fā)利用我國(guó)胡桃楸和核桃資源，研發(fā)具有防癌、抑癌、治癌功能的保健食品、藥品提供相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）和二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司；胡桃醌（Julgone）購(gòu)買(mǎi)自源葉公司；胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)買(mǎi)自O(shè)XOID公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和氨芐青霉素購(gòu)買(mǎi)自生工公司；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：日立F-4700熒光光譜儀，Jasco J-815圓二色譜儀，戴爾T440塔式服務(wù)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Pin1及其突變體原核表達(dá)與純化

Pin1及其突變體H59A、L61A、C113A、S114和S154A重組質(zhì)粒pET-19b由實(shí)驗(yàn)室保存。首先將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，然后接種在含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，待其長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期時(shí)，18 ℃，加入IPTG誘導(dǎo)10 h。離心收集菌體，然后重懸菌體，超聲破碎，高速離心，棄沉淀，收集上清。將上清液倒入 Ni2+-NTA-Sepharose親和層析柱中，先用 20 mmol/L咪唑溶液洗脫雜蛋白，再用400 mmol/L咪唑溶液洗脫目的蛋白，最后使用超濾管去除咪唑溶液。

1.2.2 熒光光譜

在石英比色皿中，加入200 μL的5 μmol/L Pin1溶液，每次滴加適量的1 mmol/L胡桃醌溶液，測(cè)量熒光光譜，控制胡桃醌終濃度為 0、5、10、15、20和30 μmol/L。內(nèi)源熒光光譜采用295 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描波長(zhǎng)為 310~400 nm。同步熒光光譜測(cè)定使用Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，掃描范圍分別為270~310 nm和250~310 nm。激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫分別設(shè)置為5和10 nm，激發(fā)電壓為700 V，掃描速度為1200 r/mim。

1.2.3 圓二色譜

在比色皿中，加入200 μL的10 μmol/L Pin1溶液，每次滴定適量的1 mmol/L胡桃醌溶液，測(cè)量圓二色譜，控制胡桃醌終濃度為0、10和30 μmol/L。掃描速度設(shè)置為200 nm/min，響應(yīng)時(shí)間設(shè)置為2 s，掃描波長(zhǎng)為200~260 nm。

1.2.4 分子對(duì)接

Pin1的三維結(jié)構(gòu)（PDB_ID：4TNS）下載自PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。胡桃醌的三維結(jié)構(gòu)（ZINC_ID：ZINC526257）下載自ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)[11]。使用ADT工具對(duì)Pin1蛋白進(jìn)行預(yù)處理，包括去除配體，去除結(jié)晶水，加氫，加電荷以及確定對(duì)接盒子。使用AutoDock Vina 1.0軟件進(jìn)行分子對(duì)接[12]。

1.2.5 分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用GROMACS 4.6.5程序?qū)Ψ肿訉?duì)接之后的結(jié)合模型進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，使用 pdb2gmx和Ambertools程序分別獲取Pin1和胡桃醌參數(shù)文件[13]。Pin1與胡桃醌復(fù)合物的分子力場(chǎng)選用AMBER99SB，并進(jìn)行20 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬。使用GROMACS 4.6.5自帶的工具進(jìn)行模擬分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光發(fā)射光譜檢測(cè)胡桃醌與Pin1相互作用

熒光發(fā)射光譜能夠監(jiān)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)中發(fā)色基團(tuán)微環(huán)境的改變。Pin1蛋白包含三個(gè)色氨酸殘基和三個(gè)酪氨酸殘基，具有內(nèi)源熒光現(xiàn)象。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為295 nm，主要呈現(xiàn)色氨酸殘基微環(huán)境變化。如圖1a所示，隨著胡桃醌濃度的增加，Pin1的內(nèi)源熒光強(qiáng)度逐漸下降。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1中，導(dǎo)致Pin1熒光淬滅。

熒光淬滅可以分為兩種，動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，可以根據(jù)Stern-Volmer方程計(jì)算淬滅常數(shù)（Ksv）和動(dòng)態(tài)熒光淬滅速率常數(shù)（Kq）得出。公式如下所示：

式中，F(xiàn)為有胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度；F0為無(wú)胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度；τ0為胡桃醌不存在時(shí)熒光體的熒光壽命，約為10-8s[14]；[Q]為胡桃醌濃度。

根據(jù)公式 1，以F0/F對(duì)[Q]進(jìn)行線(xiàn)性擬合，做出Stern-Volmer圖，根據(jù)擬合直線(xiàn)的斜率可以得出不同溫度下的Ksv和Kq值。如圖1b和表1所示，在293 K，胡桃醌對(duì)Pin1淬滅常熟（Ksv）為1.36×104L/mol，隨著溫度的增加，Ksv值逐漸降低，表明溫度升高會(huì)導(dǎo)致胡桃醌對(duì)Pin1的淬滅程度降低，這是一個(gè)典型的靜態(tài)淬滅特征。此外，在293 K和303 K條件下，Kq值分別為 1.36×1012L/(mol·s)和 0.66×1012L/(mol·s)，均遠(yuǎn)大于最大擴(kuò)散碰撞淬滅常數(shù)2×1010L/(mol·s)[14]，進(jìn)一步表明胡桃醌對(duì) Pin1的熒光淬滅過(guò)程是靜態(tài)淬滅過(guò)程。

圖1 內(nèi)源熒光光譜圖Fig.1 Fluorescence spectra

對(duì)于靜態(tài)淬滅過(guò)程，可以使用 Lineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)方程計(jì)算結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），公式如下所示：

式中，F(xiàn)為有胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度；F0為無(wú)胡桃醌時(shí)Pin1的熒光強(qiáng)度；[Q]為胡桃醌濃度。

根據(jù)公式2，以lg[(F0-F)/F]對(duì)lg[Q]進(jìn)行線(xiàn)性擬合，做出 Lineweaver-Burk雙對(duì)數(shù)圖，以擬合直線(xiàn)的斜率和截距可以得出不同溫度下的n和Ka值。如圖1c和表1所示，在293 K條件下，Ka值為2.32×104L/mol，隨著溫度的增加，Ka值逐漸降低，表明溫度升高會(huì)導(dǎo)致胡桃醌對(duì)Pin1的結(jié)合程度降低，這也是靜態(tài)淬滅的典型特征之一。此外，在293 K和303 K條件下，n值分別為0.85和0.80，均接近1，表明胡桃醌對(duì)Pin1的結(jié)合只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表1 胡桃醌與Pin1相互作用熱力學(xué)參數(shù)Table 1 Thermodynamic parameters between juglone and Pin1

藥物與蛋白質(zhì)之間的作用力主要有氫鍵，范德華力，疏水作用力和靜電作用力，它們可以通過(guò) Van’t Hoff方程計(jì)算焓變（ΔH），熵變（ΔS）和吉布斯自由能（ΔG）來(lái)判斷[15]。公式如下所示：

式中，Ka為公式2中計(jì)算的結(jié)合常數(shù)；T為實(shí)驗(yàn)溫度；R為氣體常數(shù)。

根據(jù)公式3~5，可以分別計(jì)算出ΔH，ΔS和ΔG，結(jié)果如表1所示。在293 K和303 K條件下，ΔG分別為-24.49和-22.80 kJ/mol，表明胡桃醌與Pin1的結(jié)合是自發(fā)結(jié)合過(guò)程。根據(jù)Ross等歸納出來(lái)的熱力學(xué)規(guī)律[16,17]：當(dāng)ΔH>0和ΔS>0時(shí)，作用力為疏水作用力；當(dāng)ΔH<0和ΔS>0時(shí)，作用力為靜電作用力；當(dāng)ΔH<0和ΔS<0時(shí)，作用力為氫鍵和范德華力。在293 K條件下，ΔH和 ΔS分別是 12.97 kJ/mol和 127.83 J/(mol·K)。這個(gè)結(jié)果表明胡桃醌與Pin1的結(jié)合過(guò)程中，主要的作用力是疏水作用力。此外，胡桃醌化學(xué)結(jié)構(gòu)表明其有一個(gè)疏水性萘醌環(huán)組成，并含有一個(gè)羥基。因此，除了疏水作用力，氫鍵作用也不應(yīng)該排除，詳細(xì)的作用力類(lèi)型將在對(duì)接模型和MM/PBSA結(jié)合自由能中進(jìn)一步討論。

2.2 同步熒光光譜檢測(cè)胡桃醌對(duì) Pin1構(gòu)象的影響

同步熒光光譜可以檢測(cè)蛋白質(zhì)中色氨酸或酪氨酸微環(huán)境構(gòu)象的變化。當(dāng)Δλ（Δλ=λem–λex）分別等于15 nm和60 nm時(shí)，分別表示色氨酸和酪氨酸同步熒光光譜。如圖2a所示，當(dāng)Δλ=15 nm時(shí)，隨著胡桃醌濃度的增大，酪氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明胡桃醌可以淬滅酪氨酸內(nèi)源熒光。并且，最大發(fā)射波長(zhǎng)從 291 nm輕微紅移至293 nm，表明酪氨酸殘基周?chē)h(huán)境疏水性降低，極性增加。如圖2b所示，當(dāng)Δλ=60 nm時(shí)，隨著胡桃醌濃度的增大，色氨酸熒光強(qiáng)度逐漸降低，表明胡桃醌可以淬滅色氨酸內(nèi)源熒光。與酪氨酸同步熒光類(lèi)似，最大發(fā)射波長(zhǎng)從281 nm輕微紅移至283 nm，表明色氨酸殘基周?chē)h(huán)境疏水性降低，極性增加。

圖2 胡桃醌與Pin1相互作用同步熒光光譜。Fig.2 Synchronous fluorescence spectra between juglone and Pin1

2.3 圓二色譜檢測(cè)胡桃醌對(duì) Pin1二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

圓二色譜是最常見(jiàn)的檢測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)之一[18,19]。如圖3所示，Pin1的圓二色譜在208和222 nm附近有兩個(gè)負(fù)峰，是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。隨著胡桃醌濃度的增加，譜圖中負(fù)峰強(qiáng)度減弱，表明胡桃醌與Pin1結(jié)合會(huì)導(dǎo)致Pin1的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少。可能是胡桃醌與 Pin1中α-螺旋結(jié)構(gòu)中的氨基酸發(fā)生氫鍵締合等作用，引起Pin1空間變化，α-螺旋數(shù)量下降[20,21]。為了進(jìn)一步定量α-螺旋含量的變化，使用如下兩個(gè)公式計(jì)算：

圖3 胡桃醌與Pin1相互作用圓二色譜Fig.3 Circular dichroism between juglone and Pin1

式中，Cp表示Pin1摩爾濃度（10 μM）；n表示Pin1氨基酸殘基數(shù)（163）；l表示樣品池的厚度（0.1 cm）；MRE208表示蛋白質(zhì)在208 nm處的平均殘基橢圓率。

根據(jù)公式6和7，計(jì)算Pin1中α-螺旋含量。如圖3所示，當(dāng)加入胡桃醌和Pin1的摩爾比分別為1:0、1:1和1:3時(shí)，對(duì)應(yīng)的Pin1的α-螺旋含量為23.44%、20.11%和17.82%。表明胡桃醌會(huì)導(dǎo)致Pin1中的α-螺旋含量減少。同時(shí)譜圖形狀和峰尖位置沒(méi)有明顯變化，也進(jìn)一步說(shuō)明胡桃醌主要影響Pin1中的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

2.4 分子對(duì)接預(yù)測(cè)胡桃醌與Pin1的結(jié)合模型

分子對(duì)接是最常見(jiàn)預(yù)測(cè)藥物和蛋白結(jié)合的方法之一[22-24]。利用AutoDock Vina對(duì)胡桃醌和Pin1進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)兩者結(jié)合模型和作用機(jī)制。如圖4A所示，胡桃醌進(jìn)入 Pin1疏水空腔中，并且與關(guān)鍵殘基His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154相互接觸。為了進(jìn)一步分析胡桃醌與 Pin1中關(guān)鍵殘基作用力類(lèi)型，詳細(xì)的結(jié)果展現(xiàn)在圖4B中，胡桃醌與Cys113、Ser114和Ser154形成三個(gè)氫鍵，以及與Cys113形成一個(gè)Pi-Alkyl鍵（一種疏水作用力），與His59和Leu61形成范德華力。這個(gè)結(jié)果與熱力學(xué)參數(shù)結(jié)論一致，表明胡桃醌與Pin1的作用力類(lèi)型主要是疏水作用力，氫鍵和范德華力。

圖4 胡桃醌與Pin1相互作用預(yù)測(cè)結(jié)合模型Fig.4 Predicted binding model between juglone and Pin1

2.5 定點(diǎn)突變檢測(cè)胡桃醌與Pin1的結(jié)合殘基

為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡桃醌與 Pin1相互作用的結(jié)合模型，采用定點(diǎn)突變技術(shù)將His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154突變?yōu)楸彼釟埢Ｈ缓髮⒑阴渭拥絇in1野生型和突變體中，測(cè)量?jī)?nèi)源熒光光譜。如果突變體熒光滴定結(jié)果與Pin1野生型差異較大，表明該殘基是胡桃醌主要作用殘基，反之，則表明該殘基不是關(guān)鍵殘基。如圖5所示，突變體C113A與Pin1野生型和其它突變體結(jié)果差異較大，表明胡桃醌結(jié)合的關(guān)鍵殘基為Cys113。這個(gè)結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道是一致的，進(jìn)一步揭示胡桃醌結(jié)合Cys113殘基，導(dǎo)致Pin1酶活降低[7]。

圖5 胡桃醌對(duì)Pin1及其突變體熒光滴定結(jié)果Fig.5 Fluorescence titration between juglone and Pin1 and mutants

2.6 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分子動(dòng)力學(xué)模擬可以模擬藥物與蛋白在生理狀態(tài)下，隨時(shí)間變化的結(jié)合情況[25]。均方根偏差（RMSD）可以反映藥物與蛋白結(jié)合穩(wěn)定性。如圖6a所示，Pin1-胡桃醌（Pin1-Julgone）體系和Pin1體系在20 ns模擬時(shí)間中，RMSD值變化幅度不大，表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結(jié)合到Pin1中。然而，C113A-胡桃醌（C113A-Julgone）體系在模擬時(shí)間內(nèi)，RMSD值變化幅度明顯大于Pin1-胡桃醌和Pin1體系，表明Cys113殘基突變會(huì)影響胡桃醌對(duì)Pin1的結(jié)合。這個(gè)結(jié)果印證了突變體熒光滴定實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步表明胡桃醌結(jié)合的關(guān)鍵殘基是Cys113。均方根波動(dòng)（RMSF）可以反映藥物與蛋白結(jié)合的柔韌性。如圖6c所示，Pin1-胡桃醌體系中的His59、Leu61、Cys113、Ser114和Ser154的RMSF明顯低于Pin1體系，表明胡桃醌可以穩(wěn)定的結(jié)合到這些關(guān)鍵殘基。

圖6 胡桃醌對(duì)Pin1的分子動(dòng)力學(xué)模擬Fig.6 Molecular dynamics simulation between juglone and Pin1

蛋白質(zhì)回旋半徑(Rg)能反映藥物與蛋白結(jié)合的緊湊程度。如圖6b，Pin1-胡桃醌體系的Rg值略微低于Pin1體系，表明胡桃醌結(jié)合到Pin1，促使其結(jié)構(gòu)變得略緊湊。藥物與蛋白結(jié)合關(guān)鍵作用力之一是氫鍵，分析氫鍵的變化能揭示結(jié)合的穩(wěn)定性。如圖6d，Pin1-胡桃醌體系的氫鍵在模擬時(shí)間內(nèi)一直存在，且平均值為2.51，非常接近對(duì)接模型的結(jié)果，表明氫鍵是胡桃醌與Pin1的作用力之一。

使用MM/PBSA方法，預(yù)測(cè)了Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系結(jié)合自由能。如表2所示，Pin1-胡桃醌和C113A-胡桃醌體系的結(jié)合自由能（ΔGbind）分別為-62.93和-14.54 kJ/mol，表明Cys113殘基突變會(huì)顯著性減少結(jié)合自由能。此外，Pin1-胡桃醌體系中的范德華能（ΔEvdw），電勢(shì)能（ΔEele），極性溶劑能（ΔGpolar）和非極性溶劑能（ΔGnonpolar）分別為-78.36 kJ/mol，-1.05 kJ/mol，22.69 kJ/mol和-6.38 kJ/mol。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1過(guò)程中，范德華力具有十分重要的作用。此外，Pin1-胡桃醌體系中的非極性自由能（ΔEvdw+ΔGnonpolar）和極性自由能（ΔEele+ΔGpolar）分別為-84.74和21.69 kJ/mol。表明胡桃醌結(jié)合到Pin1過(guò)程中，非極性自由能利于結(jié)合，而極性自由能不利于結(jié)合。

表2 MM/PBSA結(jié)合自由能分析(kJ/mol)Table 2 Analysis of binding energy using MM/PBSA method

3 結(jié)論

本文通過(guò)熒光光譜，圓二色譜，分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等技術(shù)，研究胡桃醌與Pin1的相互作用。熒光光譜結(jié)果表明，胡桃醌對(duì)Pin1的熒光淬滅機(jī)制是典型的靜態(tài)淬滅，兩者形成Pin1-胡桃醌復(fù)合物。同步熒光光譜表明，胡桃醌結(jié)合到Pin1過(guò)程中淬滅了色氨酸和酪氨酸內(nèi)源熒光，最大波長(zhǎng)輕微紅移，導(dǎo)致其構(gòu)象改變。此外，圓二色譜結(jié)果表明，胡桃醌結(jié)合到Pin1中，導(dǎo)致α-螺旋含量降低。熱力學(xué)參數(shù)，分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明，胡桃醌結(jié)合到 Pin1過(guò)程中，疏水作用力，氫鍵和范德華力是最要作用力。對(duì)接模型，突變體熒光滴定和分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果揭示了胡桃醌主要作用于Cys113殘基。本研究提供了Pin1與胡桃醌相互作用的一些數(shù)據(jù)，有助于進(jìn)一步了解胡桃醌對(duì)Pin1抑制機(jī)理，為綜合利用我國(guó)胡桃楸和核桃資源開(kāi)發(fā)功能性食品、藥品提供一定的科學(xué)依據(jù)。