張萌，陽愛國，安翠紅，侯巍，郭莉，袁東波，尹杰，莫茜，郭楊，吳宣，高露，王新

（1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西楊凌 712100）（2.四川省動物疫病預防控制中心，四川成都611130）（3.陜西省疾病預防控制中心，陜西西安 710054）（4.四川省疾病預防控制中心，四川成都 610041）

近年來，羊奶因其與人類乳汁的相似性比牛奶更高、營養(yǎng)豐富、易于消化吸收等特點備受人們喜愛，甚至被稱為“奶中之王”[1]。陜西省因其特殊的地理位置和歷史原因，奶山羊產(chǎn)業(yè)鏈發(fā)展迅速，富平縣甚至被授予“中國羊乳之都”稱號。2018年，陜西省啟動了“千億級奶山羊全產(chǎn)業(yè)鏈”工程。奶山羊產(chǎn)業(yè)備受關(guān)注，人們對羊奶及其制品的需求越來越大。而羊是導致布魯氏菌病流行與爆發(fā)的主要食源性動物。據(jù)統(tǒng)計，2018年陜西省共突發(fā) 4起布魯氏菌病疫情、報告發(fā)病 15例[2]。因此，對布魯氏菌病的防治與快速診斷刻不容緩。

布魯氏菌（Brucellaspp.）是一種無運動性、無莢膜、兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，且具有較強的致病性和宿主特異性[3]。1985年，布魯氏菌被系統(tǒng)地分為了6個種19個型，包括牛種布魯氏菌（B.abortus）8個型、豬種布魯氏菌（B.suis）5個型、羊種布魯氏菌（B.melitensis）3個型、犬種布魯氏菌（B.canis）、綿羊附睪種布魯氏菌（B.ovis）和沙林鼠布魯氏菌（B.neotome）各1個型[4]。由感染布魯氏菌而引起的人畜共患疾病稱為布魯氏菌?。˙rucellosis，以下簡稱布?。?。最易感染布病的動物包括牛、羊和豬[5]。動物通過食用被污染的飼料和接觸被感染的動物而患病?；疾『蟮膭游锉憩F(xiàn)為流產(chǎn)、不孕、產(chǎn)奶量下降等癥狀[6]。人類通過接觸被感染的動物、食用被污染的肉類或者奶制品而患病[2]。眾所周知，布病已經(jīng)對畜牧業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失并且嚴重影響其發(fā)展，甚至威脅到人類的健康安全。因此，建立一種快速、簡單、靈敏的方法檢驗布魯氏菌顯得尤為重要。

目前，用于檢測布魯氏菌的方法主要包括病原學檢測、血清學檢測及分子生物學方法[7]。其中最常用的檢測方法是病原學檢測，即分離培養(yǎng)出目標菌株，被稱作是檢測布病的“黃金標準”。但該方法對實驗室的要求較高、檢測周期較長、靈敏度較低且常用于發(fā)病期檢測[8,9]。血清學檢測包括試管凝集試驗、補體結(jié)合試驗、虎紅平板凝集試驗等方法，則具有單克隆抗體制備周期長且復雜、實際操作中限制條件較多、檢測成本較高等缺點[10,11]。分子生物學檢測包括聚合酶鏈式反應（PCR）、實時定量PCR（RT-PCR）等方法，具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但這些大多需要昂貴的專業(yè)儀器設備，不適合現(xiàn)場檢驗[11-14]。2000年，Notomi研發(fā)出了一種新的分子檢測技術(shù)，稱為環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）。這一技術(shù)采用 DNA 聚合酶和一組四個引物對DNA靶序列進行擴增，反應可在60~65 ℃等溫條件下進行擴增，一般60 min即可反應完全[15]。與傳統(tǒng)的檢測方法比較，LAMP具有高特異性、高靈敏度、快速高效等優(yōu)點，適合基層與現(xiàn)場檢驗[15-19]。

基于以上優(yōu)點，LAMP已經(jīng)被廣泛應用于病原微生物的快速檢測方面，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、腸球菌耶爾森氏菌、志賀氏菌等[20-23]。本研究主要針對布魯氏菌的保守基因Omp2a設計3對LAMP引物，對布魯氏菌進行檢測，優(yōu)化LAMP反應條件與反應體系，建立了一種特異、靈敏和可視化的LAMP檢測布魯氏菌的方法。同時，本研究還檢測了該方法的特異性和靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和樣本來源

布氏菌病活疫苗（豬種S2株、牛種A19株、羊種M5株）為天康生物股份有限公司產(chǎn)品；大腸桿菌ATCC25922、沙門氏菌 H9812、金黃色葡萄球菌ATCC29213、單核細胞增生李斯特菌CMCC 54004、蠟樣芽孢桿菌ATCC14579、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和福氏志賀氏菌對照菌株均來西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院食源性病原微生物實驗室保存。實際羊種菌布魯氏菌核酸樣本及該方法的驗證由某疾病預防控制中心實驗室提供。

1.1.2 主要試劑

基因組抽提試劑盒購自杭州博日科技有限公司；10×ThermoPol Buffer、MgSO4、Bst DNA Polymerase Large Fragment聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司；dNTP Mix（10 mM）購自上海笛醫(yī)生物科技有限公司；甜菜堿購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；羥基萘酚藍（HNB）購自上海源葉生物科技有限公司；SYBR Green Ⅰ（10000×）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要儀器與設備

高壓滅菌鍋（MDF-U5411）購自上海申安高壓儀器設備有限公司；超凈工作臺（NU-425-400E）購自蘇州凈化設備有限公司；超純水機（Milli-Q Synthesis）購自法國Millpro公司；PCR儀（Mycircle）購自美國Bio-Rad公司；電泳儀（DYY-6C）購自北京六一生物科技有限公司；凝膠成像系統(tǒng)（GEL DOC XR）購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物的設計與合成

在GenBank數(shù)據(jù)庫中檢索布魯氏菌Omp2a基因序列，選取不同種屬的Omp2a基因序列（AY008719.1、MF966952.1、MF966953.1、AY008721.1、AY008720.1），通過Clustal軟件比對分析，選取特異性好的保守片段。通過在線軟件 PrimerExplorer V5（http://primerexplorer.jp/e/）設計一套 LAMP引物，包括兩條外引物（F3、B3）、兩條內(nèi)引物（FIP、BIP）和兩條環(huán)引物（LF、LB），如表1所示。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，用ddH2O溶解后分裝，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 LAMP引物序列Table 1 Primer sequence of LAMP assays

1.2.2 細菌基因組DNA的提取

取購買布魯氏菌活疫苗株S2、A19和M5加入無菌水后，放置于80 ℃水浴鍋內(nèi)滅活30 min，按照細菌基因組提取試劑盒使用說明進行布魯氏菌基因組的提取，測定DNA模板濃度及純度，存放于-20 ℃冰箱備用。其它菌株的DNA由西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院食源性病原微生物實驗室保存。

1.2.3 LAMP檢測方法的優(yōu)化

根據(jù)Bst DNA Polymerase Large Fragment聚合酶的說明書推薦，將雙蒸水、10×ThermoPol Buffer、MgSO4、dNTP Mix、甜菜堿、FIP和BIP、F3和B3、LF和LB、HNB、Bst DNA Polymerase Large Fragment和模板DNA（含量為10 ng、1 ng、0.1 ng等）在冰浴條件下依次加入到EP管中，混合均勻，于加熱器或PCR儀恒溫孵育1 h。反應結(jié)束后，將EP管于85 ℃下滅活5 min，擴增產(chǎn)物于4 ℃冰箱中保存。

1.2.3.1 LAMP反應溫度優(yōu)化

設置反應溫度為 60 ℃、61 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、65 ℃和66 ℃，以S2標準菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的反應溫度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適反應溫度。

1.2.3.2 LAMP反應時間優(yōu)化

設置反應時間為15、30、45、60、75和90 min，以S2標準菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的反應時間。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適反應時間。

1.2.3.3 Mg2+濃度優(yōu)化

設置Mg2+的濃度分別為0 mM、2 mM、4 mM、6 mM、8 mM、10 mM、12 mM和14 mM，以S2標準菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的Mg2+濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適Mg2+濃度。

1.2.3.4 Bst聚合酶濃度優(yōu)化

設置Bst聚合酶的濃度分別為0.192 U/μL、0.256 U/μL、0.320 U/μL、0.384 U/μL 和 0.448 U/μL，以 S2標準菌株的 DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的Bst聚合酶濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適Bst聚合酶濃度。

1.2.3.5 甜菜堿濃度優(yōu)化

設置甜菜堿的濃度分別為0 M、0.2 M、0.4 M、0.6 M、0.8 M和1.0 M，以S2標準菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的甜菜堿濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適甜菜堿濃度。

1.2.3.6 dNTPs濃度優(yōu)化

設置dNTPs的濃度分別為0 mM、0.6 mM、1.0 mM、1.4 mM、1.8 mM和2.2 mM，以S2標準菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的dNTPs濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適 dNTPs濃度。

1.2.3.7 內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化

設置內(nèi)外引物的濃度比分別為2:1、4:1、6:1、8:1、10:1和12:1，以S2標準菌株的DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的內(nèi)外引物濃度比。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適內(nèi)外引物濃度比。

1.2.3.8 可視化染料HNB濃度優(yōu)化

設置HNB的濃度分別為0 μM、60 μM、120 μM、180 μM 和 240 μM，以 S2標準菌株的 DNA（25.6 ng/μL）為反應模板，檢測LAMP最適的HNB濃度。根據(jù)瓊脂糖凝膠結(jié)果選擇最適HNB濃度。重復3次。

1.2.4 LAMP擴增結(jié)果檢測

1.2.4.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測

LAMP反應擴增后的產(chǎn)物是若干個不同長度的莖環(huán)DNA混合物，其在瓊脂糖凝膠電泳的中的條帶呈現(xiàn)特殊的梯狀結(jié)構(gòu)。使用濃度為 2%的瓊脂糖凝膠進行電泳。電泳時，DNA Marker（DL2000）與LAMP擴增產(chǎn)物的點樣量分別是5 μL和2 μL，電壓為120 V，電泳時間為35 min。電泳后的凝膠置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外成像。成像后的電泳條帶為特殊的梯狀結(jié)構(gòu)，則擴增結(jié)果為陽性；若無條帶，則擴增結(jié)果為陰性。

1.2.4.2 可視化HNB染料檢測

LAMP反應過程中會消耗混合溶液中的Mg2+。而羥基萘酚藍（HNB）是一種常見的金屬指示劑，含有不同濃度Mg2+的混合液體顏色不同。在白色背景下觀察擴增產(chǎn)物的顏色：若擴增產(chǎn)物保持紫羅蘭色不變，則表明DNA未擴增，結(jié)果為陰性；若擴增產(chǎn)物顏色變?yōu)樗{色，則表明DNA擴增，結(jié)果為陽性。

1.2.5 LAMP特異性檢測

為確保建立方法的特異性，用優(yōu)化好的反應體系及反應條件檢測3種布魯氏菌及7種非布魯氏菌，每種細菌的DNA模板添加量為1 μL。

1.2.6 LAMP靈敏度檢測

采用10倍梯度稀釋法檢測建立方法的檢測限。每個梯度的DNA模板取1 μL加于優(yōu)化好的反應體系中，在最適反應條件下擴增并判斷結(jié)果。

1.2.7 聚合酶鏈式反應（PCR）比較驗證

常規(guī)PCR的引物及反應條件來自文獻[24]，其具體序列如表2所示。

表2 PCR引物序列Table 2 Primer sequence of PCR assays

PCR 反應體系（25 μL）：2.5 μL 的 10×Buffer、5 μL dNTP Mix（2.5 mM）、3 μL MgSO4（25 mM）、0.5 μL F3（12.5 μM）、0.5 μL B3（12.5 μM）、0.125 μL Taq酶（5 U/μL）、1 μL DNA 模板（含量分別為 10 ng、1 ng、0.1 ng等），用雙蒸水補足體系。

PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min后在4 ℃下保存。

1.2.8 LAMP重復性檢測

本研究所有實驗均重復3次及以上，以確保實驗具有良好的重復性與穩(wěn)定性。

1.2.9 LAMP進行陽性布魯氏菌DNA和陰性對照菌DNA的驗證檢測

將本研究建立好的LAMP最佳試劑及其擴增條件提供給某疾病預防控制中心實驗室進行9份陽性布魯氏菌DNA和4份陰性對照菌DNA（包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌和蠟樣芽胞桿菌）的驗證檢測。

1.2.10 統(tǒng)計學分析

計算LAMP檢測方法相對常規(guī)分離方法檢測布魯氏菌的敏感性和特異性。敏感性和特異性的計算公式如下：

LAMP和PCR的檢測結(jié)果，采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對敏感性和特異性進行卡方檢驗，p<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP檢測方法優(yōu)化結(jié)果

優(yōu)化后的LAMP檢測方法體系如表3所示。

表3 優(yōu)化后的LAMP體系Table 3 Optimization of LAMP assays

優(yōu)化后LAMP檢測方法的反應條件是：62 ℃反應45 min。

2.1.1 LAMP反應溫度的優(yōu)化結(jié)果

在設置好的溫度梯度下進行LAMP反應，結(jié)果如圖1所示。由圖可見，在設置的反應梯度溫度范圍內(nèi)，LMAP擴增都有較清晰的梯狀條帶。其中反應溫度為62 ℃時，LAMP的梯狀條帶最為清晰明亮。因此，選擇62 ℃為LAMP反應最適溫度。

圖1 反應溫度的優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of reaction temperature

2.1.2 LAMP反應時間的優(yōu)化結(jié)果

在設置好的時間梯度下進行LAMP反應，結(jié)果如圖2所示。由圖可見，反應時間為30 min時，LAMP擴增即出現(xiàn)清晰明亮的梯狀條帶且呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。為保證建立LAMP方法的靈敏度及穩(wěn)定性，選擇45 min為最優(yōu)反應時間。

圖2 反應時間的優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimization of reaction time

2.1.3 Mg2+濃度的優(yōu)化結(jié)果

在設置好的Mg2+濃度下進行LAMP反應，結(jié)果如圖3所示。由圖可見，Mg2+濃度為4 mM~14 mM時，LAMP擴增即出現(xiàn)清晰明亮的梯狀條帶且呈現(xiàn)穩(wěn)定趨勢。其中Mg2+濃度為8 mM時，擴增產(chǎn)物最多，電泳條帶最為清晰明亮。當Mg2+濃度過高時，電泳條帶變得模糊，LAMP反應被抑制。因此，選取8 mM為最適Mg2+濃度。

圖3 Mg2+濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimization of the concentration of Mg2+

2.1.4 Bst聚合酶濃度的優(yōu)化結(jié)果

在設置好的Bst聚合酶濃度下進行LAMP反應，結(jié)果如圖4所示。由圖可見，Bst聚合酶濃度在0.192 U/μL~0.448 U/μL范圍內(nèi)，LAMP擴增均出現(xiàn)清晰明亮的梯狀條帶。在設置范圍內(nèi)，Bst聚合酶濃度對LAMP擴增的影響無明顯差異。根據(jù)前期實驗經(jīng)驗，選取0.320 U/μL為最適Bst聚合酶濃度。

圖4 Bst聚合酶濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.4 Optimization of the concentration of Bst DNA polymerase

2.1.5 甜菜堿濃度的優(yōu)化結(jié)果

甜菜堿濃度對LAMP反應的影響結(jié)果如圖5所示。由圖可見，在設置的甜菜堿濃度范圍內(nèi)，不同濃度的甜菜堿對LAMP反應的影響無顯著差異。

2.1.6 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果

dNTPs濃度對LAMP反應的影響結(jié)果如圖6所示。由圖可見，dNTPs濃度在1.0~2.0 mM范圍內(nèi)，LAMP反應均擴增出清晰的電泳條帶。因此，選擇條帶最為清晰明亮的1.4 mM為最適dNTPs濃度。

圖6 dNTPs濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.6 Optimization of the concentration of dNTPs

2.1.7 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果

內(nèi)外引物濃度比對LAMP反應的影響結(jié)果如圖7所示。由圖可見，在設置的內(nèi)外引物濃度比范圍內(nèi)，LAMP反應均擴增出梯狀條帶。其中內(nèi)外引物濃度比為 8:1時，電泳條帶最為清晰明亮。因此，選擇 8:1為最佳內(nèi)外引物濃度比。

圖7 內(nèi)外引物濃度比的優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization of the concentration ratio of internal and external primers

2.1.8 可視化染料HNB濃度的優(yōu)化結(jié)果

HNB濃度比對LAMP反應的影響結(jié)果如圖所示。由圖8a可見，在設置的HNB濃度范圍內(nèi)，LAMP反應均擴增出明亮的梯狀條帶，說明HNB對LAMP反應無抑制作用。由圖8b可見，HNB濃度為180 μM時，陽性對照與空白對照之間的顏色差異最為明顯。因此，選擇180 μM為最佳HNB濃度。

圖8 LAMP反應HNB濃度的優(yōu)化結(jié)果Fig.8 Optimization of the concentration of HNB

2.2 LAMP特異性檢測結(jié)果

用7種非布魯氏菌的DNA以及3種布魯氏菌的DNA為模板，采用前面優(yōu)化過的 LAMP體系，在62 ℃恒溫反應45 min，在自然光下觀察反應管顏色。同時，取2 μL反應產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析。如圖9所示，加入3種布魯氏菌模板的反應管顏色均由紫羅蘭色變?yōu)樗{色，與電泳結(jié)果一致。表明設計引物的特異性良好，能準確區(qū)分布魯氏菌與非布魯氏菌。

圖9 LAMP特異性檢測結(jié)果Fig.9 Specificity of LAMP assays

2.3 LAMP靈敏度檢測結(jié)果

將濃度為256 ng/μL的DNA模板10倍梯度稀釋，并取1 μL加到LAMP反應體系中。62 ℃反應45 min后，靈敏度檢測結(jié)果如圖10。結(jié)果表明，建立的LAMP方法檢測限為2.56×10-4ng/μL，且可視化結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致。

圖10 LAMP靈敏度檢測結(jié)果Fig.10 Sensitivity of LAMP assays

2.4 PCR結(jié)果分析

如圖11所示，PCR反應的檢測限為 2.56×10-3ng/μL，靈敏度低于建立好的LAMP檢測方法。

2.5 LAMP進行陽性布魯氏菌DNA和陰性對照菌DNA的驗證檢測結(jié)果

將構(gòu)建成功的 LAMP方法用于檢測某疾病預防控制中心實驗室提供9份陽性布魯氏菌DNA和4份陰性對照菌 DNA進行驗證檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAMP法相對 9份陽性布魯氏菌 DNA和 4份陰性對照菌DNA（包括大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌和蠟樣芽胞桿菌）的敏感性和特異性均為 100%，無統(tǒng)計學差異（見圖12，p>0.05）。

圖12 LAMP檢測9份陽性布魯氏菌DNA和4份陰性對照菌DNA的驗證檢測結(jié)果Fig.12 Detection results of 9 DNA samples of Brucella spp. and 4 DNA samples of control bacteria by LAMP

2.6 討論

布魯氏菌的寄主具有多樣性，動物與人類普遍易感[25]。近年來，消費者們越來越關(guān)注食品安全問題，同時食品行業(yè)和政府部門也表達了快速簡便檢驗布魯氏菌的迫切需求。目前，常用于檢測布魯氏菌的病原學檢測方法、免疫學檢測方法、PCR和RT-PCR檢測方法都具有一定的局限性，并不適用于資源匱乏的基層檢驗與野外現(xiàn)場檢驗[26,27]。作為一種新型的分子檢驗技術(shù)，LAMP是一種特異性強、靈敏度高、操作簡單、反應快速的檢測方法，且它不需要昂貴的儀器只要一臺穩(wěn)定的水浴鍋即可滿足試驗條件[28]。

自LAMP方法建立以來，經(jīng)過數(shù)年的發(fā)展，該方法已經(jīng)較為成熟。其結(jié)果的判定方法從一開始的濁度檢測和凝膠電泳檢測發(fā)展為現(xiàn)在的添加染料檢測方法。濁度儀機器昂貴且使用范圍小，凝膠檢測耗時長且容易造成污染，而添加染料檢測結(jié)果方便觀察且不易污染[29]。與其他研究采用SYBR Green、鈣黃綠素、SYTO-82等染料相比，本研究采用HNB染料作為指示劑，經(jīng)過濃度優(yōu)化后具有不影響LAMP擴增、能準確靈敏的反應結(jié)果、顏色對比明顯、價格低廉且無需熒光即肉眼可見等優(yōu)點。這種不需要開蓋檢測結(jié)果的方法大大減少了氣溶膠的形成與擴散，降低了LAMP發(fā)生假陽性的概率。

3 結(jié)論

為了建立一種快速、高效、特異性好的基于LAMP檢測布魯氏菌的方法，本研究針對布魯氏菌的保守基因Omp2a設計了一套六個引物，包括兩條外引物（F3、B3）、兩條內(nèi)引物（FIP、BIP）和兩條環(huán)引物（LF、LB）。為了檢驗 LAMP方法的特異性，本研究對 10種菌株純培養(yǎng)物（包括3種布魯氏菌和7種非布魯氏菌）和9個實際樣本進行了檢測，并與常規(guī)病原學檢測方法進行了比較。結(jié)果表明，本研究優(yōu)化好的LAMP方法可以準確區(qū)分布魯氏菌與非布魯氏菌，在所用實際樣本檢測中的敏感性與特異性均為 100%。同時，靈敏度檢驗結(jié)果表明優(yōu)化好的 LAMP檢測方法的靈敏度（檢測限為2.56×10-4ng/μL）是傳統(tǒng)PCR的10倍。并且在環(huán)引物的作用下，本研究的LAMP擴增僅需45 min即可完成，較通常所需的60 min節(jié)省了時間?？偠灾?，本研究建立的LAMP方法可以準確、快速的檢驗布魯氏菌且適用于基層檢驗和現(xiàn)場檢驗。