郭桂芳 , 張希墨 , 吳琴堯 , 邱基程 , 王 杰 , 李淑媛 , 張 璐 , 龔曉會 , 郭燕熒 , 劉 欣 , 曹玉穎 , 曹興元

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所獸藥審評中心 ， 北京 海淀 100081 ; 2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193 ； 3.國家獸藥殘留基準實驗室 ， 北京 海淀 100193 ； 4.河北遠征藥業(yè)有限公司 ， 河北 石家莊 050049)

多西環(huán)素是一種半合成的四環(huán)素類廣譜抗生素，作用機制為抑制核糖體的蛋白質(zhì)合成，主要是與細菌核蛋白體的30S小亞基結(jié)合，具有高效、長效、廣譜等特點，廣泛應用于獸醫(yī)臨床[1]。鹽酸多西環(huán)素主要用于對多西環(huán)素敏感的胸膜肺炎放線桿菌所引起的豬呼吸道疾病的治療。獸藥市場上存在的劑型有鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、鹽酸多西環(huán)素注射液、鹽酸多西環(huán)素片、鹽酸多西環(huán)素顆粒、鹽酸多西環(huán)素子宮注入劑等[2]，并且國內(nèi)外有較多關于多西環(huán)素制劑在豬、羊、兔和牛等動物體內(nèi)單次使用的藥代動力學研究報道[3-7]，而對于鹽酸多西環(huán)素制劑在動物體內(nèi)多次使用的研究很少。本試驗以10 mg/(kg·bw)劑量經(jīng)口連續(xù)5次灌服給予多西環(huán)素可溶性顆粒進行豬的多次內(nèi)服給藥藥代動力學研究，獲取了相關的藥動學參數(shù)，研究結(jié)果將對多西環(huán)素制劑在豬病臨床上的合理應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

除特殊注明外，本試驗所用試劑均為色譜純，由Milli-Q超純水儀制取的超純水，符合GB/T 6682二級用水規(guī)定。

1.1 試劑與藥物 多西環(huán)素可溶性顆粒(規(guī)格100 g∶50 g， 批號：120518)，由河北遠征藥業(yè)有限公司提供；鹽酸多西環(huán)素標準品：純度≥98.7%，購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；超純水：由Milli-Q超純水儀制取；乙腈、甲醇(均為色譜純)，甲酸(質(zhì)譜純)，均購自北京賽默飛世爾生物化學制品有限公司。

1.2 儀器與設備 超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)儀：配電噴霧離子源，廠家：Waters；分析天平：感量0.000 01 g，廠家：德國賽多利斯科學儀器有限公司，型號：R200D；天平：感量0.01 g，廠家：上海舜宇恒平科學儀器有限公司，型號：MP2002；高速冷凍離心機，廠家：德國Eppendorf公司，型號：Centrifuge 58042R；渦漩混合器，廠家：北方同正有限公司，型號：HQ-60-II。

1.3 試劑制備 鹽酸多西環(huán)素標準儲備溶液：準確稱取2 mg鹽酸多西環(huán)素標準品，溶于二甲亞砜中配成1 mg/mL的標準溶液，置-20 ℃冰箱中保存。取儲備液依次用乙腈配制成100.0、200.0、1 000.0、5 000.0、10 000.0 ng/mL 和20 000.0 ng/mL標準工作溶液，置-20 ℃條件下保存。

1.4 試驗動物 健康三元雜交豬8頭(雌雄各半)，試驗地點位于北京市海淀區(qū)蘇家坨周春生養(yǎng)豬場，體重25～30 kg，自由飲水，給藥前禁食12 h。

1.5 給藥和樣品采集 多西環(huán)素可溶性顆粒(規(guī)格100 g∶50 g，批號：120518)，由河北遠征藥業(yè)有限公司提供。推薦用藥方法：以多西環(huán)素計。用藥前先在飲用水中按0.3 g/L劑量加入檸檬酸調(diào)節(jié)水的酸堿度，再按用藥劑量將鹽酸多西環(huán)素顆粒加入調(diào)節(jié)酸度后的飲用水中徹底溶解后使用，藥物溶液24 h 更換1次。

三元雜交豬給藥前禁食12 h，并稱量體重，8頭豬以10 mg/(kg·bw) 劑量經(jīng)口連續(xù)5次灌服給予多西環(huán)素可溶性顆粒水溶液，每日1次。第1、2、3、4次內(nèi)服給藥前和內(nèi)服給藥后3 h采集血液。第5次給藥前和給藥后0.16、0.33、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24、36 h和48 h分別于前腔靜脈采血5 mL，置于肝素鈉抗凝采血管中，3 800 r/min離心10 min，吸取上層血漿放于聚丙烯管中，密封，避光，-20 ℃ 短時保存待用。由于試驗過程中第8號豬在第3天灌服給藥后發(fā)生嘔吐現(xiàn)象，將灌服的藥物部分吐出，故將該頭豬的試驗樣本剔除并且未進行儀器檢測分析。

1.6 檢測方法

1.6.1 樣品前處理 取血漿50 μL，加入300 μL乙腈，渦動2 min，4 ℃下以8 000 r/min離心20 min，取出上清液，進入UPLC-MS/MS分析。

1.6.2 色譜條件 超高效液相色譜儀：廠家：Waters， 型號：Waters Acquity UPLC；色譜柱：廠家：Waters，型號：BEH C18，2.1 mm×100 mm，粒徑1.7 μm； 流動相：0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：5 μL；梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution program

1.6.3 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜儀：Waters Quattro Premier；離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監(jiān)測；離子源溫度：150 ℃；脫溶劑溫度：350 ℃；毛細管電壓：3.0 kV；脫溶劑氣流速：700 L/h； Q1、Q3均為單位分辨率；測定藥物定性、定量離子對及對應的錐孔電壓、碰撞能量，見表2。

表2 多西環(huán)素的定性定量離子對、錐孔電壓和碰撞能量Table 2 Qualitative,quantitative ion and cone voltage,collision energy of doxycycline

1.7 數(shù)據(jù)分析 經(jīng)建立的UPLC-MS/MS方法對樣本檢測后，采用Winnolin 8.1藥代學軟件中的非房室模型分析方法對藥時數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 分析方法的確證

2.1.1 特異性 分析不同來源的豬空白血漿樣品(n=20)，目標化合物的保留時間附近沒有雜質(zhì)干擾。

2.1.2 線性范圍 在10～2 000 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，方法的線性關系良好，相關系數(shù)≥0.99，標準曲線見圖1。y=27.123 3x+73.878 5，r2=0.999。

圖1 多西環(huán)素標準曲線Fig.1 Standard curve of doxycycline

2.1.3 準確度和精密度 本方法在20、500、1 000 ng/mL 三個添加濃度的回收率在96.53%～106.76%；批內(nèi)變異系數(shù)均小于5.28%，批間變異系數(shù)均小于6.12%。試驗結(jié)果見表3。

表3 血漿中添加多西環(huán)素的回收試驗結(jié)果Table 3 The results of doxycycline recovery in plasma

2.1.4 靈敏度 以3倍信噪比測得血漿中多西環(huán)素的檢測限為5 ng/mL，以10倍信噪比測得血漿中多西環(huán)素的定量限為10 ng/mL。

2.1.5 血漿中多西環(huán)素藥物濃度數(shù)據(jù) 豬多次內(nèi)服給予多西環(huán)素飲水劑后，血藥濃度數(shù)據(jù)見表4，藥時曲線見圖2、3。通過藥動學軟件計算的藥動學參數(shù)見表5、6。

表4 豬多次內(nèi)服給予多西環(huán)素飲水劑后血漿中的藥物濃度Table 4 Drug concentration in plasma after multiple oral administration of doxycycline in swine (ng/mL)

圖2 最后1次給藥后多西環(huán)素在血漿中的藥時曲線圖(96～144 h,n=7)Fig.2 The drug concentration-time curve of doxycycline in plasma after the last administration (96-144 h,n=7)

圖3 豬多次內(nèi)服多西環(huán)素飲水劑后多西環(huán)素在血漿中的藥時曲線圖[3～144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]Fig.3 The drug plasma concentration-time curve of doxycycline in swine after multiple oral administration [3-144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]

表5 豬最后1次內(nèi)服多西環(huán)素飲水劑后的藥代動力學參數(shù)[96～144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]Table 5 Pharmacokinetic parameters of doxycycline after the last oral administration in swine[96-144 h,10 mg/(kg·bw),n=7]

表6 豬多次內(nèi)服多西環(huán)素飲水劑后的藥代動力學參數(shù)[3～144 h，10 mg/(kg·bw),n=7]Table 6 Pharmacokinetic parameters of doxycycline after multiple oral administration in swine [3-144 h，10 mg/(kg·bw),n=7]

3 討論

本試驗建立了豬血漿中多西環(huán)素的UPLC-MS/MS檢測方法，能夠滿足測定要求，樣品測定靈敏度較高。

本試驗中，豬連續(xù)5 d以10 mg/(kg·bw)的劑量灌服給藥多西環(huán)素，平均穩(wěn)態(tài)血藥濃度Css為(0.66±0.20)μg/mL，波動程度為(169.15±5.24)%，累積指數(shù)為1.15±0.03，說明多西環(huán)素飲水劑連續(xù)灌服無蓄積性。AUC0-τ為(15.91±4.95)(μg/mL)·h，與單次給藥時的AUC基本一致。在本試驗中，多西環(huán)素飲水劑最后1次灌服給藥后，其終末消除半衰期(T1/2)約為(8.12±0.84) h，達峰時間(Tmax)和峰值濃度(Cmax)分別為(6.86±1.07)h和(0.52±0.30)μg/mL，平均藥時曲線下面積(AUC)為(8.58±0.42)(μg/mL)·h，平均滯留時間(MRT)為(13.05±0.46)h。先前本實驗室開展的豬單次內(nèi)服10 mg/(kg·bw)多西環(huán)素飲水劑型水溶液后的藥動學結(jié)果顯示：平均滯留時間MRTlast為(12.82±3.34) h，終末消除半衰期T1/2為(11.65±4.80) h，達峰時間為(4.13±1.89) h，達峰濃度為(0.87±0.48)μg/mL，藥-時曲線下面積AUClast為(11.07±4.19) (μg/mL)·h。本次試驗中除了AUClast低于單次給藥的AUClast外，其他參數(shù)差異不大，造成AUClast的前后差異的原因可能是由于動物個體間的變異，此外先前的單次給藥平均藥時曲線下面積AUC動物個體間數(shù)據(jù)變異較大，也由于本次試驗中所用豬的平均體重比單次藥動學試驗所用動物少5 kg。

Bousquet等[8]研究發(fā)現(xiàn)，豬通過飲水內(nèi)服鹽酸多西環(huán)素[每日飲用量在11.8～13.3 mg/(kg·bw)]，連用8 d。 自由飲用藥水，累積指數(shù)為1.8±0.4，平均血藥濃度介于0.7～1.0 μg/mL，消除半衰期為(5.9±1.0)h，與本次試驗結(jié)果基本一致。Prats等[9]研究發(fā)現(xiàn)，豬通過飲水服用鹽酸多西環(huán)素10 mg/(kg·bw)， 連用5 d。自由飲用藥水30 min后，平均血藥濃度為0.26 μg/mL，自由飲用藥水12 h 后，血藥濃度達到穩(wěn)定狀態(tài)，介于(0.67±0.82) μg/mL和(2.14±1.66) μg/mL之間，與本次試驗的結(jié)果基本一致。Mil等[10]研究發(fā)現(xiàn)，豬通過單次口服給藥多西環(huán)素10 mg/(kg·bw)，終末消除半衰期T1/2為(4.83±1.74)h，達峰時間為(2.00±1.10)h，達峰濃度為(2.01±0.91)μg/mL,藥時曲線下面積AUC0-inf為(10.56±3.97)(μg/mL)·h，與本試驗的結(jié)果基本一致。翟克影等[11]研究發(fā)現(xiàn)，豬通過灌胃給藥鹽酸多西環(huán)素水溶液5 mg/(kg·bw)，連續(xù)給藥4 d。藥物吸收迅速、分布廣泛，消除半衰期為(6.02±0.83) h，藥時曲線下面積AUC為(17.07±2.80)(μg/mL)·h，達峰時間為(5.42±0.25) h，峰濃度Cmax為(1.09±0.26) μg/mL。Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，豬通過肌內(nèi)注射鹽酸多西環(huán)素20 mg/(kg·bw)， 其終末消除半衰期(T1/2)約為(8.28±0.91) h，達峰時間(Tmax)和峰值濃度(Cmax)分別為4.00 h和(4.53±0.46)μg/mL，平均藥時曲線下面積(AUC0-24)為(55.51±5.72)(μg/mL)·h。鹽酸多西環(huán)素不同制劑通過不同的給藥方式所獲得的藥動學參數(shù)也有一定的差異，由此比較峰濃度大約呈2倍關系于本次口服給藥[10 mg/(kg·bw)]，其余參數(shù)大致相同，說明口服給藥能產(chǎn)生良好的藥物作用。Lavet公司在其產(chǎn)品Ladoxyn(鹽酸多西環(huán)素顆粒)的產(chǎn)品說明中報道，多西環(huán)素在豬體內(nèi)的消除半衰期為4～4.2 h。反復以20 mg/(kg·bw)的劑量給豬口服飲水Ladoxyn 500 mg/g顆粒5 d后， 多西環(huán)素的穩(wěn)態(tài)血藥濃度范圍為1.0～1.5 μg/mL， 該數(shù)值約為本次試驗結(jié)果的2倍，本試驗的結(jié)果數(shù)據(jù)基本符合線性相關。比利時Huvepharma公司的HydroDoxx(或DiluDox)50%豬用多西環(huán)素可溶性粉的產(chǎn)品說明中報道，豬以10 mg/(kg·bw)的劑量連續(xù)飲水給藥5 d后，穩(wěn)態(tài)最大血藥濃度(Cmax-ss)為 0.83 μg/mL(SD=0.29)，與本試驗的結(jié)果研究一致。西班牙Divasa公司的50%鹽酸多西環(huán)素可溶性粉產(chǎn)品說明中報道，以10.8 mg/(kg·bw) 口服后，在豬體內(nèi)藥物治療的穩(wěn)態(tài)濃度變化由清晨的最小值0.40 μg/mL到傍晚后達到最大值0.87 μg/mL。按10 mg/(kg·bw)服用鹽酸多西環(huán)素后其穩(wěn)態(tài)的血藥濃度在藥物治療后12～96 h內(nèi)變化為0.75～0.93 μg/mL，與本試驗的結(jié)果基本一致。

本試驗結(jié)果顯示，多次灌服給藥獲得的多西環(huán)素藥動學特征與國外報道的同類制劑基本一致。本試驗在推薦給藥方案下所獲得的藥動學參數(shù)表明多西環(huán)素可溶性顆粒在豬體內(nèi)具有吸收迅速，達峰時間短，消除較慢，血中平均滯留時間較長的特征，使得藥物能夠發(fā)揮較長時間的藥物作用且無蓄積性。在國內(nèi)沒有多西環(huán)素在動物體內(nèi)多次給藥的相關研究，本試驗為多西環(huán)素可溶性顆粒在豬病臨床上的應用提供了科學依據(jù)。