張艷芳 ， 謝芝勛 ， 鄧顯文 ， 謝志勤 ， 張民秀 ， 羅思思 ， 謝麗基 ， 范 晴 ， 曾婷婷 ， 黃嬌玲 ， 王 盛 , 劉加波

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 廣西 南寧 530001)

雞傳染性貧血病毒(Chicken infectious anemia virus，CIAV)可引起3周齡以內(nèi)的雞嚴(yán)重貧血、出血，尤其是骨髓造血組織和胸腺等淋巴組織嚴(yán)重萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致雛雞發(fā)生免疫抑制[1-3]。雞細(xì)小病毒(Chicken parvovirus，ChPV)屬雞腸道病毒，主要侵害雛雞，可引起以腹瀉、精神抑郁、體溫調(diào)節(jié)障礙、生長遲緩、營養(yǎng)吸收障礙等為特征的急性或慢性腸道性疾病，與矮小綜合征和營養(yǎng)不良綜合征有關(guān)[4-5]，這兩種疾病在雞群中普遍存在，均可引起雛雞發(fā)育不良，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展，特別是有混合感染時(shí)，危害程度尤為明顯，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大損失[6]。因此建立有效的檢測(cè)方法，加強(qiáng)規(guī)模化養(yǎng)雞場(chǎng)對(duì)CIAV和ChPV的監(jiān)測(cè)及防控極其重要。多重 PCR可同時(shí)檢測(cè)和鑒別多種病原體，具有靈敏度高、快速、特異性好等優(yōu)點(diǎn)，且操作簡易、能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化[7]，在鑒別診斷多種病原混合感染的臨床病例中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8]。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了 2 對(duì)CIAV和ChPV特異性引物，建立了能夠同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒的雙重PCR方法。

1 材料與方法

1.1 主要病原體 CIAV、ChPV、禽腎炎病毒(ANV)、禽流感病毒H9亞型(AIV-H9)、雞傳染性喉氣管炎病毒(AILTV)、雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城疫病毒(NDV)、禽呼腸孤病毒(ARV)、馬立克病毒(MDV)和大腸桿菌(E.coli)，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 DNA/RNA提取試劑盒、細(xì)菌DNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、2×TaqPCR Mix，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、pMD 18T Vector、100 bp marker ladder，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 主要儀器 移液槍，購自法國Gilson公司；生物安全柜，購自美國Baker公司；PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)，均購自美國Bio-Rad公司；NanDrop ND-2000 微量核酸檢測(cè)儀，購自美國Thermo Fisher公司；高速離心機(jī)，購自美國Beckman公司；電泳儀，購自北京六一儀器公司。

1.4 方法

1.4.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中CIAV的VP基因和ChPV的NS1基因的保守序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物和DNASTAR軟件進(jìn)行比對(duì)篩選，通過NCBI的Blast驗(yàn)證，設(shè)計(jì)篩選出了2對(duì)CIAV和ChPV的特異性引物(表1)。引物由深圳華大基因公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.4.2 DNA/RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄 參照核酸抽提試劑盒說明書抽提CIAV、ChPV、MDV和AILTV 的DNA及ANV、AIV-H9、IBV、NDV和ARV的RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；同時(shí)抽提E.coli的DNA，均保存于-30 ℃ 備用。

1.4.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化 擴(kuò)增體系：2×PCR Mix 12.5 μL，CIAV和ChPV的DNA各1 μL作為混合模板，2對(duì)引物不同比例共加入2 μL(濃度均為20 μmol/L)，最后用ddH2O補(bǔ)足25 μL。對(duì)雙重PCR各引物比例進(jìn)行優(yōu)化，選擇最佳比例，再設(shè)置梯度PCR選擇最適退火溫度，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；94 ℃ 45 s，退火溫度50.0～60.0 ℃，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min，12 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，拍照保存。

1.4.4 特異性試驗(yàn) 應(yīng)用優(yōu)化的雙重PCR對(duì)AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli的核酸進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法的特異性。

1.4.5 敏感性試驗(yàn) 使用NanDrop ND-2000 微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定CIAV和ChPV的核酸濃度，將已知濃度的模板按 10 倍梯度稀釋，逐一進(jìn)行雙重 PCR 擴(kuò)增，評(píng)估本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法的靈敏性。

1.4.6 臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn) 采集自2018年11月—2019年5月廣西南寧地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)雞場(chǎng)的 40 份雞泄殖腔拭子樣品，樣品采集放入含有雙抗的生理鹽水中，置于采樣箱，當(dāng)日帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行抽提和反轉(zhuǎn)錄，應(yīng)用所建立的雙重PCR方法和普通PCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)重復(fù)2次。將目的條帶回收，克隆，挑選陽性菌送至賽默飛廣州分公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化 最佳引物組合比例：CIAV上下游引物各0.4 μL，ChPV上下游引物各0.6 μL(圖1)；最佳退火溫度為56.1 ℃(圖2)；最佳CIAV和ChPV的雙重PCR 反應(yīng)體系：2×PCR Mix 12.5 μL，2對(duì)引物上下游共2 μL，模板混合2 μL，加ddH2O補(bǔ)足25 μL。CIAV和ChPV均可以特異的擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶，無非特異性擴(kuò)增。

圖1 雙重PCR引物優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Primers optimization test results of duplex PCRM:100 bp DNA ladder; N: 陰性對(duì)照; 1～9:CIAV引物和ChPV引物分別為0.9～0.1 μL和0.1～0.9 μLM:100 bp DNA ladder; N:Negative control; 1- 9:CIAV primer and ChPV primer were 0.9- 0.1 μL and 0.1- 0.9 μL， respectively

圖2 雙重PCR退火溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Annealing temperature optimization test results of duplex PCRM: 100 bp DNA ladder; N: 陰性對(duì)照; 1: 50.0 ℃; 2: 50.7 ℃; 3: 51.9 ℃; 4: 53.8 ℃; 5: 56.1 ℃; 6: 58.0 ℃; 7: 59.2 ℃; 8: 60.0 ℃M: 100 bp DNA ladder; N: Negative control; 1: 50.0 ℃; 2: 50.7 ℃; 3: 51.9 ℃; 4: 53.8 ℃; 5: 56.1 ℃; 6: 58.0 ℃; 7: 59.2 ℃; 8: 60.0 ℃

2.2 雙重PCR的特異性試驗(yàn) CIAV擴(kuò)增出219 bp的特異性目的條帶，ChPV擴(kuò)增出 384 bp 的特異性目的條帶；而AIV-H9、NDV、ARV、MDV、AILTV、IBV和E.coli均沒有出現(xiàn)特異性條帶(圖3)。

圖3 雙重PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Specificity test results of duplex PCRM:100 bp DNA ladder; N: 陰性對(duì)照; 1: CIAV和ChPV; 2: ANV; 3: ChPV; 4: AIV-H9; 5: NDV; 6: ARV; 7: MDV; 8: AILTV; 9: IBV; 10: E.coliM: 100 bp DNA ladder; N: Negative control; 1: CIAV and ChPV; 2: ANV; 3: ChPV; 4: AIV-H9; 5: NDV; 6: ARV; 7: MDV; 8: AILTV; 9: IBV; 10: E.coli

2.3 雙重PCR的敏感性試驗(yàn) 使用NanDrop ND-2000 微量核酸檢測(cè)儀測(cè)得CIAV和ChPV的濃度分別為66 ng/μL和78 ng/μL，10倍梯度稀釋后，對(duì)各梯度的模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的雙重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)到66 fg的CIAV和78 fg的ChPV(圖4)。

圖4 雙重PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Sensitivity test results of duplex PCRM:100 bp DNA marker; N:陰性對(duì)照; 1～9: CIAV 66 ng、6.6 ng、660 pg、66pg、6.6pg、660 fg、66 fg、6.6 fg、0.66 fg和ChPV 78 ng、7.8 ng、780 pg、78 pg、7.8 pg、780 fg、78 fg、7.8 fg、0.78 fgM:100 bp DNA marker; N:Negative control; 1- 9: CIAV 66 ng,6.6 ng, 660 pg, 66 pg, 6.6pg， 660 fg, 66 fg, 6.6 fg,0.66 fg and ChPV 78 ng, 7.8 ng, 780 pg, 78 pg, 7.8 pg, 780 fg, 78 fg, 7.8fg, 0.78 fg

2.4 臨床樣品的檢測(cè) 使用所建立的雙重PCR對(duì)40份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出2份CIAV和ChPV的混合感染、1份CIAV陽性、3份ChPV陽性，重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致，并且與單重PCR檢測(cè)及測(cè)序方法得出的結(jié)果一致，部分臨床樣品檢測(cè)結(jié)果見圖5。陽性測(cè)序結(jié)果與相應(yīng)序列同源性高達(dá)96%～99%。

圖5 雙重PCR臨床樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.5 The detection results of clinical samples by duplex PCRM: 100 bp DNA ladder; P: 陽性對(duì)照; N: 陰性對(duì)照; 1～11: 檢測(cè)樣品M: 100 bp DNA ladder; P: Positive control; N: Negative control; 1-11: Samples testing

3 討論

PCR檢測(cè)方法具有操作簡易、特異性強(qiáng)、敏感性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。多重 PCR方法，即在一個(gè)體系中加入多種引物和模板[9]，1次PCR就能檢測(cè)多種病原體，當(dāng)天就能出結(jié)果。建立多重PCR檢測(cè)方法關(guān)鍵在于引物的設(shè)計(jì)和篩選，目的片段大小要有合適的梯度，確保產(chǎn)物量相對(duì)平衡，目的片段大小相差不宜超過300 bp，各引物退火溫度盡可能相近[10]。本試驗(yàn)根據(jù)CIAV和ChPV的保守基因序列設(shè)計(jì)和篩選出2對(duì)特異性引物，目的條帶大小分別為219 bp和384 bp，通過優(yōu)化反應(yīng)條件和體系，確定最佳引物比例分別是CIAV 0.4 μL和ChPV 0.6 μL。設(shè)置50.0～60.0 ℃的退火溫度梯度，均能特異地?cái)U(kuò)增出目的片段，56.1 ℃為本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法最佳退火溫度。

通過CIAV和ChPV雙重PCR的特異性和敏感性試驗(yàn)，對(duì)常見的雞病AIV-H9、MDV、AILTV、IBV、NDV、ARV和E.coli等進(jìn)行檢測(cè)，均沒有出現(xiàn)特異性目的條帶。最低能檢出66 fg CIAV和78 fg ChPV，具有很高的敏感性，完全能夠達(dá)到快速檢測(cè)這兩種雞病的目的。

利用本試驗(yàn)建立的CIAV和ChPV雙重PCR檢測(cè)方法，對(duì)40份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，與單重PCR和測(cè)序得出的結(jié)果一致。因此，本試驗(yàn)建立的雙重PCR 檢測(cè)方法適用于CIAV和ChPV混合感染的快速檢測(cè)，不僅節(jié)約時(shí)間、降低成本，還能減少污染，以期為這兩種病毒的防控提供參考。