李才善 ， 郭子涵 ， 陳宋琴 ， 馬 英 ， 祖力亞·克力木江 ， 劉一凡 ， 李盈科 ， 郭慶勇

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 ， 新疆 烏魯木齊 830052)

環(huán)形泰勒蟲病(Theileriosis)是一種由環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata)引起的血液性原蟲病，該病在牛群體的所有年齡段都會發(fā)生，但主要發(fā)生在幼小年齡段[1]。其主要臨床癥狀為引起患病牛體溫升高、體表淋巴結(jié)腫大、眼結(jié)膜黃染、貧血等[2]。環(huán)形泰勒蟲病的發(fā)生具有一定的季節(jié)性且多呈急性經(jīng)過，由于其較高的發(fā)病率和死亡率給養(yǎng)牛業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。該病在新疆地區(qū)作為一種常見多發(fā)的疾病[4-7]，嚴(yán)重地制約了當(dāng)?shù)匾耘橹鞯男竽翗I(yè)的發(fā)展。位于吐魯番地區(qū)的托克遜縣是新疆地區(qū)農(nóng)牧業(yè)資源豐富的地區(qū)之一，據(jù)統(tǒng)計托克遜縣牛存欄量為2.56萬頭，并且當(dāng)?shù)氐男竽翗I(yè)仍在不斷地發(fā)展中[8]。位于阿勒泰地區(qū)的富蘊(yùn)縣曾經(jīng)是新疆三大畜牧縣之一，目前仍是重要的畜產(chǎn)品基地，據(jù)2011年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)?shù)氐纳髷?shù)量為100.97萬頭[9]。本次試驗選擇新疆吐魯番和阿勒泰主要奶牛產(chǎn)區(qū)中的托克遜縣和富蘊(yùn)縣為試驗點(diǎn)，通過PCR方法檢測環(huán)形泰勒蟲在不同地區(qū)、不同品種牛等分組中的感染情況，并利用Tams1基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。旨在為托克遜縣和富蘊(yùn)縣2個地區(qū)的牛環(huán)形泰勒蟲病的防控工作提供流行病學(xué)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 樹脂型基因組DNA提取試劑盒，購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂糖、DL-2 000 marker、核酸染料(GelStain)、2×EasyTaq?PCR Super Mix，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器 PCR儀(型號:BIORAD T100)、紫外凝膠成像儀(型號:Gel Doc2000)，均由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；核酸電泳儀(型號:DYCP-31DN)，由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 樣品采集 本試驗從吐魯番地區(qū)的托克遜縣(n=30)和阿勒泰地區(qū)的富蘊(yùn)縣(n=50)共采集牛全血樣品80份，將每份牛全血樣品收集到裝有EDTA-K2的5 mL抗凝管中，并按照不同地區(qū)、不同性別、不同年齡段、不同品種對采集的牛全血樣品進(jìn)行分組。為保證血液樣品質(zhì)量，每支抗凝管中收集的血液體積不超過抗凝管總?cè)莘e的2/3，經(jīng)溫和顛倒混勻后放置于4 ℃環(huán)境中，帶回實驗室進(jìn)行后續(xù)試驗。本次試驗所采集的牛全血樣品信息見表1。

表1 托克遜縣和富蘊(yùn)縣牛全血樣品采集信息Table 1 Collection information of whole bovine blood samples in Toksun county and Fuyun county (份)

1.4 試驗方法

1.4.1 環(huán)形泰勒蟲PCR檢測 按照樹脂型基因組DNA提取試劑盒說明書提取牛全血基因組DNA，并在-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。參照文獻(xiàn)[10]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成可檢測環(huán)形泰勒蟲的Tams1基因特異性引物(上游引物序列:5′-GTAACCTTTAAAAACGT-3′，下游引物序列:5′-GTTACGAACATGGGTTT-3′)。運(yùn)用PCR方法進(jìn)行環(huán)形泰勒蟲檢測，PCR擴(kuò)增體系：2×EasyTaq?PCR Super Mix 12.5 μL，上游和下游引物各1 μL，牛全血DNA模板1 μL，并加入9.5 μL超純水將體系補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，擴(kuò)增結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證。挑選出驗證結(jié)果顯示陽性的環(huán)形泰勒蟲PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.2 環(huán)形泰勒蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析 將本試驗測序獲得的托克遜縣和富蘊(yùn)縣2個地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，并與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中所上傳的相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比對。從BLAST比對結(jié)果中篩選出不同地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列，利用貝葉斯方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，使用卡方檢驗進(jìn)行差異顯著性檢驗。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)形泰勒蟲Tams1基因的PCR檢測 通過PCR擴(kuò)增得到大小約為721 bp的特異性條帶(圖1)，與預(yù)期的目的片段大小相符。

圖1 托克遜縣和富蘊(yùn)縣部分血液樣品環(huán)形泰勒蟲PCR檢測結(jié)果Fig.1 PCR results of Theileria annulata in some blood samples of Toksun county and Fuyun countyM： DL-2 000 maker； P： 陽性對照； 1～3： 托克遜縣環(huán)形泰勒蟲陽性DNA樣品； 4～6： 富蘊(yùn)縣環(huán)形泰勒蟲陽性DNA樣品M:DL-2 000 maker; P: Positive control; 1-3: Positive DNA samples of Theileria annulata from Toksun county; 4-6: Positive DNA samples of Theileria annulata from Fuyun county

2.2 環(huán)形泰勒蟲感染情況 通過PCR方法檢測出托克遜縣和富蘊(yùn)縣2個地區(qū)的牛感染環(huán)形泰勒蟲的總感染率為31.25%(25/80)。在以不同地區(qū)為分組時，托克遜縣的環(huán)形泰勒蟲感染率最高，為40.00%(12/30)，富蘊(yùn)縣最低，為26.00%(13/50)；在以性別為分組時，環(huán)形泰勒蟲感染率在公牛中最高，為36.84%(7/19)，在母牛中最低，為29.51%(18/61)；在以不同年齡為分組時，環(huán)形泰勒蟲感染率最高出現(xiàn)在1～3歲的牛群體中，其感染率為50.00%(18/36)，在7～9歲的牛群體中最低，為6.67%(1/15)；在以不同品種為分組時，雜交品種中環(huán)形泰勒蟲感染率最高，為35.71%(5/14)，在荷斯坦牛中最低，為28.89%(13/45)。通過卡方檢驗分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)形泰勒蟲感染率在不同地區(qū)與不同年齡段組內(nèi)存在顯著性差異(P<0.05)，在性別和不同品種組內(nèi)不存在顯著性差異(P>0.05)。分析結(jié)果見表2。

表2 托克遜縣和富蘊(yùn)縣環(huán)形泰勒蟲在不同分組中的感染情況Table 2 Infection of Theileria annulata in different groups in Toksun county and Fuyun county

2.3 環(huán)形泰勒蟲Tams1基因系統(tǒng)進(jìn)化分析 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明，環(huán)形泰勒蟲托克遜縣地方株和富蘊(yùn)縣地方株與河南地方株之間親緣關(guān)系較近，與印度、西班牙等地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲地方株之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?；诃h(huán)形泰勒蟲Tams1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖2。

圖2 基于環(huán)形泰勒蟲Tams1基因構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the Tams1 gene of Theileria annulata▲: 本文測定的托克遜縣環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列; ●: 本文測定的富蘊(yùn)縣環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列▲: The Tams1 gene sequences of Theileria annulata in Toksun county were determined; ●: The Tams1 gene sequences of Theileria annulata in Fuyun county were determined

3 討論

本試驗通過PCR方法檢測出托克遜縣和富蘊(yùn)縣2個地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲總感染率為31.25%。其中，托克遜縣環(huán)形泰勒蟲感染率為40.00%，該檢測結(jié)果低于沙塔爾·卡哈爾等[11]于2013年和何曉東等[12]于2014年所報道的吐魯番地區(qū)環(huán)形泰勒蟲感染率(51.60%～57.70%)，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是當(dāng)?shù)丶訌?qiáng)了對環(huán)形泰勒蟲的防控工作。對首次進(jìn)行環(huán)形泰勒蟲檢測的富蘊(yùn)縣，其環(huán)形泰勒蟲感染率(26.00%)低于本次檢測結(jié)果中的托克遜縣地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲感染率(40.00%)。本次環(huán)形泰勒蟲感染率的檢測結(jié)果在以性別為分組時發(fā)現(xiàn)，公畜的感染率(36.84%)高于母畜(29.51%)；在以不同年齡段為分組時發(fā)現(xiàn)，環(huán)形泰勒蟲感染率在1～3歲的牛群體中最高(50.00%)，在7～9歲的牛群體中最低(6.67%)；在以不同品種為分組時發(fā)現(xiàn)，環(huán)形泰勒蟲感染率在雜交品種最高(35.71%)，在荷斯坦牛中感染率最低(28.89%)。通過卡方檢驗發(fā)現(xiàn)，環(huán)形泰勒蟲的感染率在不同地區(qū)和不同年齡段的分組中存在顯著性差異(P<0.05)，在不同性別和不同品種的分組中不存在顯著性差異(P>0.05)。上述結(jié)果表明，環(huán)形泰勒蟲在托克遜縣和富蘊(yùn)縣2個 地區(qū)有著不同的流行情況,且1～3歲的牛群體易感染環(huán)形泰勒蟲。因此，在實際的牛養(yǎng)殖過程中應(yīng)該加強(qiáng)對1～3歲牛群體的保護(hù)，如有經(jīng)臨床診斷確診為由環(huán)形泰勒蟲感染而導(dǎo)致牛患病時，應(yīng)及時采用有效的治療方法[2,13-16]進(jìn)行治療。

在利用環(huán)形泰勒蟲Tams1基因序列[17]進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析時發(fā)現(xiàn)，環(huán)形泰勒蟲托克遜縣地方株和富蘊(yùn)縣地方株與河南地方株間親緣關(guān)系較近，但與印度、西班牙等其他地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲地方株間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。產(chǎn)生上述結(jié)果的原因可能是由于本次試驗有限的Tams1基因序列樣本數(shù)量所導(dǎo)致的。因此，對于2個不同地區(qū)的環(huán)形泰勒蟲地方蟲株間的親緣關(guān)系有待進(jìn)行更深層次的研究。