徐子恒 ， 汪 敏 ， 王 粲 ， 周辰瑜 ， 楊耀炎 ， 韋 平

(廣西大學養(yǎng)禽與禽病研究所 ， 廣西 南寧 530000)

沙門菌(Salmonella)在自然界中分布廣泛，是一種重要的人獸共患病原菌，也是一種重要的食品源性病原菌，極易污染食品、水、畜禽動物及其產品[1]，人或動物一旦攝入了含有大量沙門菌的食物，可引發(fā)敗血癥、急性胃腸炎等中毒性疾病[2]。在我國，由沙門菌引起的食物中毒也是居細菌性食物中毒的首位[3]。沙門菌的致病機制多樣，致病性強弱與其毒力因子表達密切相關，而研究表明，沙門菌毒力相關基因主要分布于毒力島、菌毛、鞭毛、脂多糖和質粒等[4]。所以明確攜帶毒力基因對于沙門菌感染后的治療至關重要。沙門菌不僅血清型復雜，目前已發(fā)現超過2 600種[1]，而且絕大多數血清型能在人和動物間交叉?zhèn)魅尽＜f沙門菌也是較流行的血清型之一，同時，吉韋沙門菌感染宿主非常廣泛，不僅可以感染人[5-7]，還可以感染動物及動物性肉品[8-9]，所以食品生產鏈的養(yǎng)殖、屠宰及銷售等任何一個環(huán)節(jié)被其污染，危害顯而易見[10]。目前，抗生素治療仍是防治沙門菌感染的主要方法，但隨著藥物選擇性壓力的加大，多重耐藥沙門菌亦隨之出現，而耐藥性可以沿著食品鏈傳播到環(huán)境或人[9,11]，成為公共健康的潛在威脅，從而更加難以防控。為了更好地控制沙門菌在整個食品鏈的源頭上污染，對養(yǎng)殖環(huán)節(jié)沙門菌開展流行病學調查和耐藥性分析，將對整個食品鏈防控沙門菌污染及人類生命安全具有重要意義。所以本試驗開展種雞場不同生產環(huán)節(jié)中吉韋沙門菌的分離鑒定、耐藥表型與毒力基因檢測及腸桿菌基因間重復共有序列的聚合酶鏈反應(Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR)基因分型，為減少吉韋沙門菌在食品鏈源頭污染動物性食品提供依據，對在食品鏈源頭上降低吉韋沙門菌對公共安全的潛在威脅有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 SC培養(yǎng)基、XLD培養(yǎng)基、沙門菌屬生化試劑盒，均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；沙門菌屬診斷血清(60種)、A～F多價血清，均購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；GreenTaqMix、DL2 000 DNA marker，均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物有限公司；引物合成及測序由北京六合華大基因有限公司完成；大腸桿菌質控菌株(ATCC25922)由廣西壯族自治區(qū)疾病控制中心贈予。PCR儀，美國Applied Biosystems公司產品。

1.2 細菌分離鑒定 無菌采集某種雞場不同生產環(huán)節(jié)(種雞、種蛋、孵化后期死胚、1日齡殘次雞)的組織樣品265份，并參照實驗室建立的方法[12-13]進行細菌分離、PCR檢測、生化鑒定及血清學鑒定。

1.3 耐藥表型鑒定 采用Kirby-Bauer(K-B)藥敏紙片擴散法對分離吉韋沙門菌進行17種抗菌藥物的敏感性檢測[14]，同時以大腸桿菌ATCC25922為質控菌株。

1.4 毒力基因檢測 參照本實驗室前期建立的毒力基因(表1)的檢測方法進行檢測[1]。

表1 毒力基因及其引物序列Table 1 Virulence genes and their primer sequences

1.5 ERIC-PCR基因分型 ERIC-PCR反應參照實驗室前期方法進行，獲得的ERIC-PCR指紋圖譜利用軟件Gel-Pro Analyzer 4.0和NTSYS-pc進行遺傳關系聚類樹狀圖分析[12]。

2 結果

2.1 吉韋沙門菌的分離鑒定 經細菌分離及PCR檢測(圖1)、生化鑒定(表2)血清分型公式為3,10∶l,v∶1,7，確定獲得8株吉韋沙門菌(3.02%，8/265)。其中在種雞場的孵化后期死胚中分離獲得5株， 在1日齡殘次雞的內臟實質器官中分離獲得3株。

圖1 分離菌invA基因PCR擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis image of invA gene PCR amplification products of isolatesM：DL2 000 plus marker； 1～8：分離菌；9：陽性對照； 10：空白對照M:DL2 000 plus marker; 1- 8:Isolated bacteria; 9:Positive control; 10:Blank control

表2 分離菌生化反應結果Table 2 Biochemical reaction results of isolates

2.2 耐藥表型的測定 如表3所示，8株吉韋沙門菌分離株均對SXT、TMP、SIZ及NAL表現耐藥，對CRO、CAZ、CIP、KAN、TET、NIT、FFC等抗菌藥表現敏感。絕大多數分離株對CTX、STR敏感性表現為中介。值得注意的是，所有分離株均表現多重耐藥(圖2)。

表3 吉韋沙門菌分離株對17種抗菌藥的敏感性測定結果Table 3 Sensitivity test results of S. give strains to 17 antibiotics

圖2 不同生產環(huán)節(jié)吉韋沙門菌的ERIC基因分型、耐藥譜及毒力基因檢測情況Fig.2 ERIC genotyping,antimicrobial resistance profiles and virulence gene detection of S. give from different breeding stages注：*：孵化后期死胚和1日齡殘次雞Note：*：Dead embryos and 1 day-old defective chicks

2.3 毒力基因的檢測 結果如圖2所示，8株吉韋沙門菌分離株均攜帶stn、fimA、virK、invA、sseL、mgtC、siiE基因和sopB基因；其中1株從1日齡殘次雞中分離到的吉韋沙門菌(S-R37)攜帶毒力質?；騭pvC。

2.4 菌株親緣關系分析 利用ERIC-PCR方法對8株 吉韋沙門菌分離株進行基因分型，可分為5個ERIC型(ERIC-type，ET)(圖2)，遺傳相似性在14%～100%，結果顯示出良好的多態(tài)性并獲得了較好的指紋圖譜數據。

3 討論

本試驗在孵化后期胚胎階段和出殼后1日齡階段均分離到吉韋沙門菌的污染；主要有以下2種可能：一是從孵化間的環(huán)境污染；二是種雞感染的垂直傳播。第1種情況為環(huán)境中污染，最好的措施就是對環(huán)境消毒，實施嚴格的生物安全措施；第2種情況，需要淘汰陽性種雞以達到全群凈化的目的，但是這種副傷寒沙門菌目前并沒有好的檢測方法，凈化難度極大，這就對雞及其產品污染的風險增大，同時也會沿著食品鏈向屠宰、零售等環(huán)節(jié)傳播，甚至威脅到人的生命安全。所以利用基因分型對其污染溯源發(fā)現，8株分離株分別屬于5種不同的ERIC基因型，說明分離株存在基因多樣性，其原因可能是與沙門菌的來源不同有關；另外，在孵化后期死胚(S-D25)和1日齡殘次雞(S-R29)中各有1株 吉韋沙門菌同屬1個ERIC基因型(ET-3)，說明該公司吉韋沙門菌分離株有可能存在垂直傳播。

當前，為了更好地防控吉韋沙門菌等副傷寒沙門菌的感染，優(yōu)先選擇的方法還是利用抗菌藥治療，但隨之而來的多重耐藥問題更應予以重視。有研究表明，馮彩峰等[15]在食品鏈養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的不同食品動物(雞、豬、牛)上均分離到吉韋沙門菌，并且這些分離株對β-內酰胺類抗生素表現高耐藥率(97.30%)，表明養(yǎng)殖環(huán)節(jié)使用該類藥物頻率較高，應該謹慎使用。而這也與本試驗結果相似，8株吉韋沙門菌分離株對β-內酰胺類抗生素表現中度敏感，特別是頭孢噻肟(中介，87.5%)；另外，所有分離株對磺胺類和喹諾酮類(萘啶酸)均表現耐藥，且呈現多重耐藥，值得關注。

多重耐藥沙門菌除了因耐藥使得抗菌藥失效而帶來的危害，菌株本身所具有的毒力也是其危害之一。有研究表明，沙門菌的致病機制多樣，致病性強弱與其毒力因子表達密切相關[5]。本試驗發(fā)現，所有的菌株均攜帶毒力島、菌毛與腸毒素基因，表明吉韋沙門菌分離株均具有強毒力的潛在威脅。課題組前期研究發(fā)現，沙門菌對昆明小鼠的致病性與毒力島基因sseL有密切關系[1]，而本試驗中所有分離株均攜帶sseL基因，更加佐證了8株 吉韋沙門菌分離株均具有強致病性。另外，有1株從1日齡殘次雞中分離到的吉韋沙門菌攜帶毒力質?；騭pvC，由于毒力質粒具有傳播性，暗示應對養(yǎng)殖環(huán)節(jié)防控吉韋沙門菌的感染提高警惕，降低吉韋沙門菌通過食品鏈傳播對人造成危害的風險。