賈 婷 ， 趙素芬 ， 羅 靜 ， 劉連貴 ， 韓姝伊 ， 孫冬婷 ， 馮勝勇 ， 夏茂華 ， 黃菁晶 ， 張軼卓 ， 何宏軒 ， 張成林

(1.北京動(dòng)物園 圈養(yǎng)野生動(dòng)物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 西城 100044 ； 2.中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所 ， 北京 朝陽 100101)

毛首線蟲(Trichurussp.)，亦稱鞭蟲，屬毛首目(Trichurata)，毛首科(Trichuridae)，毛首屬(Trichuris)線蟲[1]。在全球分布，能感染多種動(dòng)物，是常見且危害嚴(yán)重的胃腸道寄生蟲[2]。臨床上，圈養(yǎng)靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)胃腸道寄生蟲敏感，尤其以毛首線蟲感染率高[3]。金絲猴對(duì)毛首線蟲極為敏感，感染率高達(dá)80%以上，并可引起發(fā)病與死亡[4]。輕度感染時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)間歇性腹瀉、貧血 ； 嚴(yán)重感染時(shí)，動(dòng)物出現(xiàn)精神沉郁、食欲減退、體溫升高、劇烈腹瀉、排血色水樣糞便并附有黏液，消瘦、貧血，甚至引起動(dòng)物死亡[5-8]。金絲猴又名仰鼻猴，國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物，現(xiàn)存5個(gè)種，其中川金絲猴(R.roxellana)、黔金絲猴(R.brelichi)和滇金絲猴(R.bieti)3個(gè)種為我國(guó)特有種。金絲猴的人工飼養(yǎng)始于1955年北京動(dòng)物園，在我國(guó)已有60年的飼養(yǎng)展出歷史[9-11]。目前，北京動(dòng)物園是全國(guó)唯一一家同時(shí)飼養(yǎng)川、黔、滇3種金絲猴，且這3種金絲猴均能進(jìn)行繁殖的單位。為保障動(dòng)物健康，北京動(dòng)物園獸醫(yī)工作者每年春、秋進(jìn)行寄生蟲普查，結(jié)果顯示，金絲猴糞便中存在大量寄生蟲蟲卵，對(duì)蟲卵結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)以毛首線蟲卵為主。雖然北京動(dòng)物園未出現(xiàn)毛首線蟲致死金絲猴病例，但病原長(zhǎng)期存在于動(dòng)物體內(nèi)，不僅會(huì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成損傷，蟲卵隨糞便排出體外，也會(huì)污染動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，感染其他動(dòng)物。為此，本試驗(yàn)開展北京動(dòng)物園飼養(yǎng)的川、黔、滇3種金絲猴毛首線蟲驅(qū)蟲試驗(yàn)研究，探索毛首線蟲在金絲猴體內(nèi)的消長(zhǎng)規(guī)律，以期為金絲猴飼養(yǎng)管理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 3只川金絲猴、4只黔金絲猴和4只滇金絲猴，資料信息見表1。11只受試動(dòng)物均飼養(yǎng)于北京動(dòng)物園金絲猴館內(nèi)，其飼養(yǎng)環(huán)境及食物結(jié)構(gòu)基本一致。試驗(yàn)過程中動(dòng)物自由采食和飲水，食物為北京動(dòng)物園金絲猴飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)餐，飲水為清潔涼開水。

表1 試驗(yàn)金絲猴信息表Table 1 Information of experimental golden monkeys

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)藥物及給藥方法 阿苯達(dá)唑(國(guó)藥準(zhǔn)字H12020496，中美天津史克制藥有限公司)。獸醫(yī)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)及前期測(cè)量數(shù)據(jù)評(píng)估動(dòng)物體重，按照10 mg/(kg·bw) 劑量將阿苯達(dá)唑拌入主食內(nèi)，由飼養(yǎng)員逐只投喂給動(dòng)物，確保用藥劑量，連續(xù)投喂3 d。

1.2.2 毛首線蟲蟲卵檢查 本試驗(yàn)分別于投喂阿苯達(dá)唑前3 d，投喂后3、6、9、15、20、25 d和30 d，采集受試動(dòng)物新鮮糞便，稱取1.0 g，采用飽和食鹽水漂浮法漂浮蟲卵，光學(xué)顯微鏡(Olympus BX51顯微成像系統(tǒng)，日本)下觀察，麥克馬斯特氏法(McMaster’s method)進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)，計(jì)算每克糞便蟲卵數(shù) (Eggs per gram of feces，EPG)[12]、蟲卵轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)，分析金絲猴體內(nèi)毛首線蟲的消長(zhǎng)規(guī)律。

蟲卵轉(zhuǎn)陰率(%)=

1.2.3 PCR檢測(cè) 稱取糞便樣品中心無污染處0.5 g，按糞便DNA提取試劑盒(D5625-01，OmegaBio-Tek,Inc.,Norcross,USA)說明書提取DNA。采用巢式PCR擴(kuò)增毛首線蟲核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔I(rDNA ITS1)基因片段。第1輪擴(kuò)增體系25 μL：2×Taq酶混合溶液(B639295，Life Biotech，India Delhi)12.5 μL，正反向引物(表2)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模版DNA 1 μL；擴(kuò)增第1輪反應(yīng)程序：Stage 1：95 ℃ 10 min；Stage 2：95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s(35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min。第2輪擴(kuò)增體系25 μL：2×Taq酶混合溶液12.5 μL，正反向引物(表2)各1 μL，ddH2O 9.5 μL，模版DNA 1 μL，模板DNA為第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物；第2輪擴(kuò)增反應(yīng)程序：Stage 1：95 ℃ 10 min；Stage 2：95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s(35個(gè)循環(huán))，最后72 ℃延伸10 min。2輪擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為1 088 bp和895 bp[13]。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物，4S Green核酸凝膠染液染色，凝膠成像儀中觀察。電泳檢測(cè)陽性且與目標(biāo)條帶大小一致者，送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。所有樣品均重復(fù)檢測(cè)3次。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST模塊進(jìn)行序列比對(duì)，確定毛首線蟲所屬類群，選取GenBank中川金絲猴毛首線蟲(MN447324.1Trichurissp.-Rhinopithecusroxellana)、黑葉猴毛首線蟲(MN447321.1Trichurissp.-Trachypithecusfrancoisi)、人毛首線蟲(KJ588071.1Trichurissp.-Homosapiens、GQ352553.1Trichuristrichiura-Homosapiens、GQ301555.1Trichuristrichiura-Homosapi-ens、JN181860.1Trichuristrichiura-Homosapiens)、食蟹猴毛首線蟲(MK192054.1Trichuristrichiura-Macacafascicularis)、黑白疣猴毛首線蟲(KJ588077.1Trichuristrichiura-black-and-white colobus)、長(zhǎng)臂猿毛首線蟲(GM991955.1Trichuriscolobae-Nomascusgabriellae)、葉猴毛首線蟲(KT186232.1Trichurissp. -leaf-monkeys)、日本獼猴毛首線蟲(KP336476.1Trichuristrichiura-Macacafuscata)已有序列和本試驗(yàn)測(cè)得的序列，共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。選擇Trichurissp.-Sundamysmuelleri(MN428391.1)序列作為系統(tǒng)發(fā)育樹的外群。在Jukes-Cantor方法中使用鄰近連接算法在MEGA 6.0中進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用1 000次 重復(fù)的Bootstrap進(jìn)行分支可靠性分析[14]。

表2 擴(kuò)增毛首線蟲內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)引物名稱及序列信息Table 2 Primers and sequence information of Trichurus ITS

2 結(jié)果

2.1 圈養(yǎng)金絲猴毛首線蟲形態(tài)學(xué)鑒定 采用飽和鹽水漂浮法和離心沉淀法富集3種金絲猴糞便中的寄生蟲蟲卵，光學(xué)顯微鏡下觀察，3種金絲猴糞便內(nèi)蟲卵均呈棕黃色，外形為腰鼓狀，卵殼厚，兩端有卵塞，依據(jù)形態(tài)判定為毛首線蟲蟲卵(中插彩版圖1)。

圖1 毛首線蟲蟲卵(400×)Fig.1 Eggs of Trichuris sp.(400×)

2.2 圈養(yǎng)金絲猴毛首線蟲分子生物學(xué)鑒定 提取金絲猴糞便基因組，使用巢式PCR 法擴(kuò)增毛首線蟲ITS1基因片段，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，目的條帶測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI進(jìn)行BLAST分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)果表明，北京動(dòng)物園川(序列編碼：12、29)、滇(序列編碼：6、23、25、33、42)、黔(序列編碼：35)3種金絲猴糞便中檢測(cè)到的毛首線蟲與秦嶺川金絲猴毛首線蟲聚為同一分支，屬于毛首線蟲屬(圖2)。

圖2 圈養(yǎng)金絲猴毛首線蟲系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Trichuris sp. of captive golden monkeys▲: 試驗(yàn)動(dòng)物名稱，其中序列編碼12、29為川金絲猴，序列編碼6、23、25、33、42為滇金絲猴,序列編碼35為黔金絲猴▲: Name of the experiment animals. Among them,12,29 is the sequence code of R. roxellana, 6,23,25,33,42 is R. bieti,and 35 is R. brelichi

2.3 圈養(yǎng)金絲猴體內(nèi)毛首線蟲驅(qū)蟲效果觀察 統(tǒng)計(jì)檢測(cè)期內(nèi)11只受試動(dòng)物的轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)，結(jié)果顯示，給藥后第6天平均蟲卵數(shù)降到最低水平，轉(zhuǎn)陰率達(dá)到64%，其后24 d內(nèi)，轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)雖有上下波動(dòng)，但均未到達(dá)驅(qū)蟲前水平(表3)，可見，阿苯達(dá)唑?qū)鸾z猴毛首線蟲有明顯的驅(qū)蟲效果。

表3 阿苯達(dá)唑?qū)θ︷B(yǎng)金絲猴體內(nèi)毛首線蟲轉(zhuǎn)陰率及平均蟲卵數(shù)的影響Table 3 Effects of albendazole on negative conversion rate and average egg number of Trichuris sp. of captive golden monkeys

進(jìn)一步對(duì)比阿苯達(dá)唑?qū)?種金絲猴驅(qū)蟲效果，川金絲猴和黔金絲猴的驅(qū)蟲效果較好，除川金絲猴在驅(qū)蟲后第10天EPG波動(dòng)較大外，這2種金絲猴在檢測(cè)期糞便內(nèi)蟲卵始終維持在較低水平(圖3A和3B)；滇金絲猴樣品雖在給藥后第3天和第6天EPG迅速降低，但在給藥后第10～30天，EPG高水平范圍波動(dòng)，雖有驅(qū)蟲效果，但不如前2種金絲猴理想(圖3C)。

圖3 驅(qū)蟲前、后金絲猴EPG隨時(shí)間的變化Fig.3 Changes of EPG of golden monkeys before and after administrationA： 川金絲猴； B： 黔金絲猴； C： 滇金絲猴A: R. roxellana; B: R. brelichi; C: R. bieti

進(jìn)一步分析11只受試金絲猴體內(nèi)毛首線蟲消長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果顯示：投藥前后3只川金絲猴和4只黔金絲猴體內(nèi)毛首線蟲EPG雖然在投藥后存在反彈和波動(dòng)，但阿苯達(dá)唑?qū)@2種共7只金絲猴的驅(qū)蟲效果均較為理想；分析4只滇金絲猴體內(nèi)毛首線蟲消長(zhǎng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)R.bieti-1和R.bieti-2體內(nèi)毛首線蟲消長(zhǎng)規(guī)律與川、黔2種金絲猴體內(nèi)毛首線蟲EPG變化規(guī)律相似，而R.bieti-3和R.bieti-4體內(nèi)毛首線蟲雖在投藥后第6天迅速下降，但隨著時(shí)間推移，其EPG迅速上升，在給藥后15～20 d，達(dá)到甚至高于2只動(dòng)物在投藥前毛首線蟲本底水平，之后二者EPG雖有下降，至投藥后第30天，EPG仍維持在3 950 和6 200(中插彩版圖4)。

圖4 投藥前、后11只受試金絲猴體內(nèi)毛首線蟲消長(zhǎng)曲線Fig.4 The perishing and growing curve of Trichuris sp. of 11 golden monkeys before and after administration

3 討論

圈養(yǎng)川金絲猴感染毛首線蟲的概率極高，且存在重復(fù)感染的現(xiàn)象[8]。根據(jù)北京動(dòng)物園寄生蟲普查結(jié)果，圈養(yǎng)川、黔、滇3種金絲猴糞便樣品中存在大量毛首線蟲蟲卵，雖然每年定期進(jìn)行驅(qū)蟲，普查仍然存在大量蟲卵。雖然目前尚未有直接因感染毛首線蟲致死的報(bào)道[15]，一旦發(fā)生混合感染，金絲猴也會(huì)發(fā)生死亡，如安徽省某動(dòng)物園曾發(fā)生1例川金絲猴金黃色葡萄球菌與毛首線蟲混合感染致死的病例[8]，臨床上毛首線蟲仍然是危害圈養(yǎng)川金絲猴種群健康的重要病原[16]。目前對(duì)圈養(yǎng)川金絲猴毛首線蟲的研究報(bào)道相對(duì)較多，但由于圈養(yǎng)金絲猴種群數(shù)量相對(duì)較少，尤其川、黔、滇3種金絲猴都有飼養(yǎng)的單位全國(guó)僅有北京動(dòng)物園，對(duì)比分析這3種金絲猴毛首線蟲感染及治療的報(bào)道甚少。因此，本試驗(yàn)可為臨床用藥和飼養(yǎng)管理提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

形態(tài)學(xué)鑒定是毛首線蟲屬重要的定種方法[17-18]，但在形態(tài)相似近緣種鑒定時(shí)，常出現(xiàn)混淆甚至錯(cuò)誤，造成寄生蟲同種異名和異種同名現(xiàn)象；形態(tài)學(xué)鑒定方法結(jié)合rDNA ITS序列分析可為毛首線蟲屬物種分類體系提供依據(jù)[19]。本試驗(yàn)結(jié)合形態(tài)學(xué)及毛首線蟲ITS1序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，北京動(dòng)物園圈養(yǎng)川、黔、滇3種金絲猴感染的毛首線蟲與秦嶺川金絲猴毛首線蟲聚為同一分支，屬毛首線蟲屬。據(jù)Xie等報(bào)道，通過比對(duì)分析毛首線蟲屬ITS和cox1基因序列，發(fā)現(xiàn)白頰長(zhǎng)臂猿、阿拉伯狒狒、長(zhǎng)尾猴、東非狒狒、北方豚尾猴和人毛首線蟲聚類為一個(gè)亞群，川金絲猴和滇金絲猴獨(dú)立于上述靈長(zhǎng)類，形成一個(gè)新亞群，提示金絲猴可能存在著不同的毛首線蟲物種[20]。

根據(jù)北京動(dòng)物園獸醫(yī)工作者臨床經(jīng)驗(yàn)，3種金絲猴存在毛首線蟲反復(fù)感染的現(xiàn)象。本試驗(yàn)給3種金絲猴投喂經(jīng)典毛首線蟲驅(qū)殺藥物阿苯達(dá)唑，結(jié)果顯示，阿苯達(dá)唑?qū)鸾z猴毛首線蟲具有良好的驅(qū)蟲效果，尤其是對(duì)川金絲猴和黔金絲猴的驅(qū)蟲效果理想，除川金絲猴在驅(qū)蟲后第10天EPG波動(dòng)較大外，這2種金絲猴在檢測(cè)期糞便內(nèi)蟲卵始終維持在較低水平?？梢?，臨床上阿苯達(dá)唑可有效驅(qū)除3種金絲猴體內(nèi)毛首線蟲蟲卵。然而，毛首線蟲的發(fā)育不需要中間宿主，在普通環(huán)境中3周左右就可以發(fā)育成為侵襲性幼蟲，高溫高濕環(huán)境下發(fā)育速度更快[21]。加之，金絲猴時(shí)而地面取食，環(huán)境中的蟲卵若未能及時(shí)清除，很容易在驅(qū)蟲后28 d左右就發(fā)生重復(fù)感染，驅(qū)蟲后采用火焰消毒可控制環(huán)境中的蟲卵[4]。為提高動(dòng)物福利、優(yōu)化游客觀覽體驗(yàn)，北京動(dòng)物園飼養(yǎng)和園藝工作者在金絲猴館舍內(nèi)種植大量綠植，圈舍內(nèi)不宜進(jìn)行火焰消毒。本試驗(yàn)雖未在驅(qū)蟲后30 d的檢測(cè)期出現(xiàn)所有個(gè)體重復(fù)感染事件，但部分個(gè)體蟲卵數(shù)存在波動(dòng)，這種驅(qū)蟲效果波動(dòng)可能與環(huán)境中蟲卵存在密切相關(guān)，可見使用阿苯達(dá)唑驅(qū)蟲后1個(gè)月可以維持動(dòng)物體內(nèi)蟲體寄生量在一個(gè)較低水平。王榮瓊等建議金絲猴群每月投服1次驅(qū)蟲藥[6]，而顧永熙等建議金絲猴毛首線蟲的驅(qū)蟲時(shí)間間隔應(yīng)為2.5個(gè)月[1]，未來開展北京動(dòng)物園毛首線蟲消長(zhǎng)規(guī)律，優(yōu)化藥物驅(qū)蟲程序，開展長(zhǎng)效驅(qū)蟲研究勢(shì)在必行。

對(duì)于滇金絲猴，雖在給藥后第3天和第6天EPG迅速降低，但在給藥后第10～30天，EPG波動(dòng)較大，雖有驅(qū)蟲效果，但不如川、黔2種金絲猴理想。進(jìn)一步分析阿苯達(dá)唑?qū)Φ峤鸾z猴毛首線蟲驅(qū)殺效果的差異，可能受試的4只滇金絲猴年齡跨度大，尤其是R.bieti-3和R.bieti-4分別為19歲和21歲，投喂阿苯達(dá)唑后，由于藥物作用在短時(shí)間內(nèi)驅(qū)殺毛首線蟲，高齡動(dòng)物由于年齡增長(zhǎng)而致全身器官功能減退和組織細(xì)胞退行性改變等生理病理的變化[22]，機(jī)體抵抗力相對(duì)較弱，局部藥物濃度下降后，寄生蟲會(huì)逐漸繁殖，重新定植所致。針對(duì)高齡動(dòng)物需要更換其他驅(qū)蟲藥物，或者在驅(qū)蟲的同時(shí)，給予適當(dāng)補(bǔ)充免疫營(yíng)養(yǎng)素，增強(qiáng)機(jī)體抵抗力，可以間接提高驅(qū)蟲藥的驅(qū)蟲效果，還可以緩解寄生蟲引起的機(jī)體應(yīng)激，修復(fù)寄生蟲分泌引起的機(jī)體損傷[23]。因此，高齡金絲猴驅(qū)蟲方案及效果有待進(jìn)一步研究。