諶玉佳， 孫智勇， 王少靜， 楊江濤， 吳本清

（1.暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510632；2.深圳愛灣醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，廣東 深圳 518000；3.中國科學(xué)院大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518000）

干血紙片法是目前新生兒遺傳代謝病篩查的主要檢測方法。據(jù)統(tǒng)計，目前我國每年制備的新生兒濾紙干血片超過1 500萬張，但是由于人員、方法、條件限制等多種因素的影響，導(dǎo)致臨床實際操作中濾紙干血片制備不合格率居高不下[1]。部分醫(yī)療機構(gòu)由于缺乏相應(yīng)的樣本制備設(shè)備，不得不“就地取材，各顯神通”地進(jìn)行操作，樣本污染、制備不符合要求的情況時有發(fā)生。2015年，全國224家新生兒篩查實驗室中不合格濾紙干血片百分比的均值為0.57%[2]。有研究結(jié)果顯示，濾紙干血片樣本不合格的主要原因為未充分干燥、未充分滲透、無法洗脫及未干燥造成的污染等[3]。目前，各大醫(yī)院普遍采用自然晾干方式對濾紙干血片進(jìn)行干燥，耗時3～4 h，需由人工判斷血片是否晾干，人為影響因素較大。此外，由于缺乏對溫度和濕度的控制，當(dāng)溫度或濕度出現(xiàn)波動時，會嚴(yán)重影響濾紙干血片樣本的質(zhì)量，易導(dǎo)致樣本制備失敗和污染。在臨床實驗室目前所能使用的各類實驗前處理設(shè)備中，水浴箱的濕度過大，不利于干燥；孵育箱或烤箱依靠溫度烘干血斑，不是自然干燥，極易出現(xiàn)影響檢測結(jié)果的情況；人工空氣對流的方式能夠提高干燥效果，但是由于空氣的擾動極易出現(xiàn)血斑凝固不均勻，而且需要專人操作，費時、費力，且無法實現(xiàn)操作的標(biāo)準(zhǔn)化。為此，本研究聚焦此技術(shù)難點，研制出濾紙干血片的專用吹干裝置（專利號：ZL201820117643.8），并對該裝置的干燥條件和干燥效果（均一性、精密度、準(zhǔn)確性）進(jìn)行評價。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

采用乙二胺四乙酸抗凝管采集健康成人自愿者靜脈血10 mL，備用。取50 μL全血滴在濾紙片上（直徑12 mm），制備濾紙干血片。

1.2 儀器與試劑

琥珀酰丙酮和非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒購自廣州市豐華生物工程有限公司，檢測儀器為API 3200三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國 AB SCIEX公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。干燥儀器為自制濾紙干血片吹干裝置（簡稱吹干裝置），見圖1。

圖1 吹干裝置實物圖

1.3 方法

1.3.1 干燥條件的篩選 實驗組1：在室溫（23±2）℃、濕度60%±5%的環(huán)境下，分別采用自然晾干、即刻（放置0 min）用吹干裝置干燥、放置10 min后用吹干裝置干燥、放置20 min后用吹干裝置干燥、放置30 min后用吹干裝置干燥5種方式干燥血片。實驗組2：在室溫（23±2）℃、濕度80%±5%的環(huán)境下，分別采用自然晾干和即刻（放置0 min）用吹干裝置干燥2種方式干燥血片。2組實驗均以放進(jìn)吹干裝置的時間計為0 min，每隔5或10 min拍照1次，記錄血片干燥狀態(tài)隨時間變化的情況。

1.3.2 濾紙干血片的色譜效應(yīng)（均一性） 取50 μL全血滴在濾紙片上，分別采用自然晾干、即刻（放置0 min）用吹干裝置干燥、放置10 min后用吹干裝置干燥、放置20 min后用吹干裝置干燥4種方式干燥血片，制成濾紙干血片。用直徑3 mm的打孔器從血片中心及周邊部位（左上、右上、左下、右下）打孔，見圖2。每種干燥方式制備6份樣本，共制備120份濾紙干血片樣本。根據(jù)2019年全國臨床檢驗室間質(zhì)量評價項目“新生兒遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查-氨基酸和?；鈮A”的評價指標(biāo)，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）測定濾紙干血片樣本中的8種氨基酸[瓜氨酸（citrulline，CIT）、亮氨酸（leucine，LEU）、甲硫氨酸（methionine，MET）、苯丙氨酸（phenylalanine，PHE）、酪氨酸（tyrosine，TYR）、纈氨酸（valine，VAL）、丙氨酸（alanine，ALA）、精氨酸（arginine，A R G）]和1 5 種?；鈮A[游離肉堿（f r e e carnitine，C0）、乙酰肉堿（acetylcarnitine，C2）、丙酰肉堿（propionyl carnitine，C3）、3-羥基丁酰肉堿（3-hydroxybutyryl carnitine，C4-OH）、丁酰肉堿（butyryl carnitine，C4）、異戊酰肉堿（cisovalerylcarnitine，C5）、戊二酰肉堿（glutaryl carnitine，C5DC）、己酰肉堿（hexanoyl carnitine，C6）、辛酰肉堿（octanoyl carnitine，C8）、癸酰肉堿（decanoyl carnitine，C10）、月桂酰肉堿（lauroyl carnitine，C12）、十四烷酰肉堿（myristoyl carnitine，C14）、棕櫚酰肉堿（palmitoyl carnitine，C16）、3-羥基棕櫚烯酰肉堿（3-hydroxypalmitoyl carnitine，C16-OH）、十八碳酰肉堿（octadecanoyl carnitine，C18）]，考察不同吹干方式對濾紙干血片色譜效應(yīng)的影響。如周邊打孔取樣的檢測結(jié)果與中央打孔取樣的檢測結(jié)果的偏差在±15%范圍內(nèi)，說明濾紙干血片的色譜效應(yīng)不明顯；如吹干裝置干燥的濾紙干血片與自然晾干的濾紙干血片的色譜效應(yīng)都不明顯，說明吹干裝置干燥方式不會影響血液在濾紙片上的均勻分布。

圖2 濾紙干血片打孔位置示意圖

1.3.3 精密度和準(zhǔn)確度 取50 μL全血滴在濾紙片上，分別采用自然晾干、放置10 min后用吹干裝置干燥（約40 min后取出血片）、放置20 min后用吹干裝置干燥（約40 min后取出血片）、放置30 min后用吹干裝置干燥（約40 min后取出血片）6種干燥方式干燥血片、放置30 min后用吹干裝置干燥（約50 min后取出血片）、放置30 min后用吹干裝置干燥（約70 min后取出血片）。用直徑3 mm的打孔器從濾紙干血片中心打孔，每種干燥方式制備6份樣本，共制備36份濾紙干血片樣本。采用LC-MS/MS檢測8種氨基酸和15種?；鈮A，計算不同干燥方式的精密度[以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示]。以自然晾干方式處理的濾紙干血片檢測結(jié)果的均值作為靶值，計算用吹干裝置干燥方式處理的濾紙干血片的檢測結(jié)果與靶值的比值，以此作為準(zhǔn)確度。參照臨床檢驗定量測定項目的室內(nèi)質(zhì)量控制監(jiān)測項目允許不精密度要求[4]，氨基酸項目的允許不精密度為±25%，肉堿項目的允許不精密度為±30%。將國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心室間質(zhì)評量評價的允許偏移范圍（氨基酸項目為±25%、肉堿項目為±30%）作為準(zhǔn)確度的評價標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示。

2 結(jié)果

2.1 干燥條件的確定

在室溫（23±2）℃、濕度60%±5%的條件下，自然晾干、即刻（放置0 min）用吹干裝置干燥、放置10 min后用吹干裝置干燥、放置20 min后用吹干裝置干燥、放置30 min后用吹干裝置干燥5種干燥方式使血片達(dá)到完全干燥的時間分別為95、40、50、50和60 min。結(jié)合實際情況，建議血片用吹干裝置干燥前的放置時間控制在20 min以內(nèi)。見表1和圖3。

圖3 室溫（23±2）℃、濕度60%±5%環(huán)境下不同干燥方式血片干燥時間

表1 自然晾干和放置不同時間后用吹干裝置干燥血片達(dá)到表面基本干燥和完全干燥的時間 min

在室溫（23±2）℃、濕度80%±5%的環(huán)境下，自然晾干和吹干裝置干燥的速度均明顯降低，血片達(dá)到完全干燥的時間均為115 min。見圖4。

圖4 室溫（23±2）℃、濕度80%±5%環(huán)境下不同干燥方式血片干燥時間

2.2 濾紙干血片的色譜效應(yīng)

無論是自然晾干，還是用吹干裝置干燥，周邊打孔（左上、右上、左下、右下）與中央打孔取樣的檢測結(jié)果除自然干燥方式中C8的差異為-15.51%、C16-OH的差異為-19.23%、即刻用吹干裝置干燥方式中C16-OH的差異為-16.67%外，其他項目的差異為-14.81%～14.61%，均在±15.00%內(nèi)，說明濾紙干血片的色譜效應(yīng)不明顯。見圖5。

圖5 不同干燥方式處理濾紙干血片后周邊打孔取樣與中央打孔取樣的偏差

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

不同干燥方式處理后濾紙干血片的氨基酸和肉堿的變異系數(shù)（CV）為2.85%～21.98%、準(zhǔn)確度為97.08%～118.18%，均符合要求。見表2。

表2 不同干燥方式處理后濾紙干血片的精密度和準(zhǔn)確度

續(xù)表2

3 討論

濾紙干血片具有“安全、簡單、穩(wěn)定性好，樣本易于儲存”的特性[5]，目前已被廣泛用于新生兒疾病篩查。此外，濾紙干血片還可用于人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒感染和藥物濫用者的快速診斷，以及遺傳性疾病、基因突變等檢測。雖然濾紙干血片憑借其突出的優(yōu)點被廣泛用于多個領(lǐng)域，但仍然存在色譜效應(yīng)、打孔位置、點血體積，以及血細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）等問題，可能會影響某些待測物的檢測結(jié)果[6-8]。

濾紙干血片樣本的采集、保存及運送流程等都有嚴(yán)格要求[9]。樣本采集后需對其進(jìn)行干燥，通常推薦在室溫通風(fēng)條件下干燥2～3 h，具體干燥時間應(yīng)根據(jù)濾紙類型、取樣體積及實驗室具體的干燥環(huán)境來決定[10]。方可欣等[11]探討了濾紙干血片制備環(huán)境中顯著影響實驗結(jié)果的理化因素，提示冷風(fēng)快速（6 min）吹干可作為濾紙干血片制備的備選方案，但是他們只簡單比較了4個指標(biāo)的檢測結(jié)果，未進(jìn)一步對干燥方式進(jìn)行方法學(xué)驗證。本研究采用自制的吹干裝置，模擬自然晾干環(huán)境，通過加快空氣對流速度的方式干燥濾紙干血片，結(jié)果顯示，將制備好的血片立即放入吹干裝置干燥，只需要40 min就可將血片完全干燥，說明該裝置可有效地提高血片的干燥速率；但由于吹干裝置未設(shè)置控濕系統(tǒng)，在濕度為80%左右的環(huán)境中，血片的干燥速率會受到限制。因此，吹干裝置使用的環(huán)境濕度必須控制在適宜的范圍內(nèi)。

若將濾紙干血片用于臨床檢測，必須考察其均一性。LENK等[8]等通過一個模型描述了干燥過程中由于邊緣水分蒸發(fā)速率比中心水分蒸發(fā)速率快而導(dǎo)致的斑點不均勻的現(xiàn)象，提示血片的干燥方式會對濾紙干血片的均勻性產(chǎn)生影響。因此，本研究通過比較血片不同部位樣本檢測結(jié)果的差異來評價血片的均一性。結(jié)果顯示，無論是自然晾干，還是采用吹干裝置干燥，不同位置樣本氨基酸和?；鈮A檢測結(jié)果的偏差絕大部分在±15.00%范圍內(nèi)，說明使用吹干裝置干燥不會造成血液樣本在濾紙片上不均勻的分布。這與李啟亮等[12]的研究結(jié)果一致，說明本研究采用自制的吹干裝置干燥血濾紙片的方式是可行的。

本研究還對不同干燥方式處理后濾紙干血片中氨基酸和?；鈮A測定的準(zhǔn)確度和精密度進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示，采用吹干裝置干燥和自然晾干制備的濾紙干血片的檢測結(jié)果一致，準(zhǔn)確度和精密度均符合要求。利用吹干裝置干燥時，干燥時間的長短對檢測結(jié)果精密度和準(zhǔn)確度的影響也較小。

綜上所述，與自然晾干相比，自制吹干裝置可有效提高血片的干燥效率，且能使其被充分、均勻地晾干。因此，自制吹干裝置可用于濾紙干血片的制備，為后續(xù)新生兒疾病篩查項目的檢測提供高質(zhì)量的樣本。