余佳佳， 李媛睿， 劉 瑛

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200092）

血流感染是臨床最主要的全身感染性疾病，嚴(yán)重威脅患者的生命安全；血流感染性休克引起低血壓后，有效的治療措施每延遲1 h，患者生存率降低7.6%[1]。血培養(yǎng)是血流感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)[2]，陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中病原菌的快速鑒定可為臨床及時(shí)、有效的抗感染治療提供重要依據(jù)[3]。按照傳統(tǒng)臨床微生物檢測(cè)的流程，血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后需要16～24 h才能出具病原菌的鑒定結(jié)果，無(wú)法滿足臨床診療的需求?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）可用于陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的直接鑒定，根據(jù)對(duì)血培養(yǎng)樣本前處理方法的不同可以分為試劑盒提取法[4]、血細(xì)胞裂解法[5]、差速離心法[6]和分離膠法[7]。其中，血細(xì)胞裂解法中使用的裂解試劑主要有十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）[8]和皂甙（saponin，SAP）[5]。本研究擬評(píng)估SDS和SAP前處理聯(lián)合MALDI-TOF MS對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本進(jìn)行快速鑒定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 樣本來(lái)源

收集2018年4月—2019年4月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本296例。

1.2 儀器和試劑

BACTECTMFX血培養(yǎng)系統(tǒng)及配套血培養(yǎng)樹(shù)脂需氧瓶和含溶血素厭氧瓶、MALDI-TOF MS儀及配套Microflex Biotyper3.0鑒定分析軟件、96孔金屬靶板、α-氰基-4-羥基肉桂酸（alphacyano-4-hydroxyc innamic acid，HCCA）基質(zhì)（美國(guó)Bruker Daltonik公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；Centrifuge 5471R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)和微量移液器（德國(guó)Eppendorf公司）。10% SDS（南通Beyotime公司）；SAP（南京酷爾生物公司）；甲酸、乙腈和三氟乙酸（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；血平板、麥康凱平板、革蘭染液（上海伊華生物技術(shù)有限公司）；巧克力平板（上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的前處理和直接MALDITOF MS鑒定 抽取1 mL報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)樣本2份，分別置于1.5 mL Eppendorf管中，分別加入100 μL SDS和SAP溶液，上下顛倒混勻后，150×g離心10 min，棄上清液，每管均加入1 mL無(wú)菌水，吹打混勻后，150×g離心2 min，棄上清液，重復(fù)該步驟1次，最后每管再加入1 mL 75%乙醇，吹打混勻后，150×g離心2 min，棄上清液，在底物中加入適量甲酸和等量的乙腈，混勻后分別取1 μL點(diǎn)在金屬靶板上，自然干燥后分別加1 μL HCCA基質(zhì)，干燥后進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。通過(guò)Microflex軟件獲得質(zhì)譜峰圖，參數(shù)設(shè)計(jì)：質(zhì)荷比（m/z）為2 000～20 000，shots為200，激光強(qiáng)度為80%，保存圖譜。采用Biotyper 3.0軟件比對(duì)質(zhì)譜峰圖，獲得鑒定結(jié)果。

1.3.2 常規(guī)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)和MALDI-TOF MS鑒定 抽取適量報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)血樣本，分別接種于血平板、麥康凱平板、巧克力平板，涂片行革蘭染色。將平板置于35 ℃孵箱中，孵育過(guò)夜后挑取單個(gè)菌落，點(diǎn)涂在金屬靶板上，加1 μL甲酸，自然干燥后加1 μL HCCA基質(zhì)，干燥后進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血培養(yǎng)樣本鑒定結(jié)果

296例陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中有272例分離出單數(shù)菌，24例分離出2種或2種以上病原菌。

與傳統(tǒng)血培養(yǎng)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后的菌落質(zhì)譜鑒定結(jié)果比較，272例分離出單數(shù)菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中，采用SDS前處理結(jié)合MALDI-TOF MS鑒定至種水平的有210例，種水平鑒定準(zhǔn)確率為77.2%；鑒定至屬水平的有226例，屬水平鑒定準(zhǔn)確率為83.1%。采用SAP前處理結(jié)合MALDITOF MS鑒定至種水平的有192例，種水平鑒定準(zhǔn)確率為70.6%；鑒定至屬水平的有206例，屬水平鑒定準(zhǔn)確率為75.7%。見(jiàn)表1。

表1 SDS和SAP聯(lián)合MALDI-TOF MS對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本病原菌的鑒定結(jié)果 株

2.2 2種前處理方法鑒定準(zhǔn)確率比較

2種前處理方法對(duì)272例陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的鑒定準(zhǔn)確率在種水平上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.079），在屬水平上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）。但SDS前處理法在葡萄球菌的鑒定上效果優(yōu)于SAP前處理法（種水平P=0.009，屬水平P＜0.001）；而SAP前處理法對(duì)非發(fā)酵菌的鑒定效果優(yōu)于SDS前處理法（屬水平P=0.048）。SDS前處理法和SAP前處理法鑒定念珠菌的效果均較好，其中SDS前處理法鑒定至種水平的準(zhǔn)確率為72.7%。見(jiàn)表2。

表2 2種前處理方法MALDI-TOOF MS鑒定準(zhǔn)確率比較 %

續(xù)表1 株

2.3 2種前處理方法鑒定分?jǐn)?shù)比較

在屬水平鑒定準(zhǔn)確的菌株中，SDS前處理法鑒定分?jǐn)?shù)＞2.0分79例，1.7～2.0分78例，＜1.7分69例；SAP前處理法鑒定分?jǐn)?shù)＞2.0分38例，1.7～2.0分65例，＜1.7分103例。

2.4 復(fù)數(shù)菌血培養(yǎng)樣本的鑒定結(jié)果

24例分離出2種或2種以上病原菌的血培養(yǎng)樣本中，SDS前處理結(jié)合MALDI-TOF MS鑒定出其中1種病原菌至種水平的準(zhǔn)確率為66.7%，其中有1例陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中2種病原菌均被鑒定至種水平；SAP前處理結(jié)合MALDI-TOF MS鑒定出其中1種細(xì)菌至種水平的準(zhǔn)確率為58.3%。2種前處理方法鑒定準(zhǔn)確率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.551）。

3 討論

血培養(yǎng)是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)引起血流感染的病原菌進(jìn)行快速鑒定至關(guān)重要，是臨床經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療重要的依據(jù)。對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本進(jìn)行前處理后直接鑒定病原菌可以將鑒定時(shí)間提前16～24 h。本研究對(duì)296例陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本進(jìn)行快速鑒定，前處理方法采用細(xì)胞裂解法，以SDS和SAP作為裂解劑，可以快速破壞宿主的紅細(xì)胞和白細(xì)胞，然后通過(guò)離心收集菌體，并進(jìn)行鑒定。本研究272例分離出單數(shù)菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中，采用SDS和SAP前處理聯(lián)合MALDI-TOF MS的種水平鑒定準(zhǔn)確率分別為77.2%和70.6%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.079）；屬水平鑒定準(zhǔn)確率分別為83.1%和75.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.034）。在屬水平鑒定準(zhǔn)確的菌株中，SDS前處理法聯(lián)合MALDI-TOF MS的鑒定分?jǐn)?shù)高于SAP前處理法，且在分離出復(fù)數(shù)菌的陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本的鑒定中，可能是由于復(fù)數(shù)菌的例數(shù)較少，2種前處理方法鑒定準(zhǔn)確率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但SDS法鑒定其中1種細(xì)菌至種水平的準(zhǔn)確率略高于SAP法，且有1例血培養(yǎng)陽(yáng)性樣本2種細(xì)菌均鑒定至種水平。SDS前處理法對(duì)葡萄球菌的鑒定效果明顯優(yōu)于SAP法，但對(duì)非發(fā)酵菌的鑒定效果略差。綜合分析發(fā)現(xiàn)，SDS前處理法的鑒定效果略優(yōu)于SAP前處理法。

本實(shí)驗(yàn)室前期利用MALDI Sepsityper Kit和分離膠法收集陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本中的菌體，進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定，種水平鑒定準(zhǔn)確率分別為72.5%和73.6%，屬水平鑒定準(zhǔn)確率分別為76.0%和77.3%，鑒定結(jié)果較SDS前處理法略差，但較SAP前處理法略好。其中試劑盒法鑒定葡萄球菌至種水平的準(zhǔn)確率僅為77.4%，分離膠法鑒定念珠菌至種水平的準(zhǔn)確率僅為19.4%，遠(yuǎn)低于SDS法[9-10]。MALDI Sepsityper Kit聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的時(shí)間約為40 min，分離膠法聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的時(shí)間約為20 min，SDS和SAP前處理法聯(lián)合質(zhì)譜鑒定的時(shí)間約為20 min。SDS前處理法聯(lián)合質(zhì)譜鑒定所需時(shí)間較少，而且鑒定準(zhǔn)確率高，成本更低，操作更簡(jiǎn)單，適合在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，SDS和SAP前處理法聯(lián)合MALDI-TOF MS直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本時(shí)，對(duì)腸桿菌科細(xì)菌的鑒定準(zhǔn)確率最高，SDS前處理法種水平鑒定準(zhǔn)確率超過(guò)90%，這可能與腸桿菌科細(xì)菌繁殖速度快，報(bào)陽(yáng)時(shí)抽取1 mL血培養(yǎng)樣本收集的菌量較多，而且腸桿菌科細(xì)菌的細(xì)胞壁較薄，容易被甲酸裂解釋放核糖體蛋白有關(guān)，因此鑒定效果最佳。但這2種前處理方法對(duì)非發(fā)酵菌的鑒定效果均較差，特別是SDS前處理法聯(lián)合質(zhì)譜鑒定至種水平的準(zhǔn)確率僅為53.2%，其中嗜麥芽窄食單胞菌的鑒定準(zhǔn)確率最差，僅為16.7%，原因還有待研究，可能與細(xì)菌繁殖較慢，收集的菌量較少有關(guān)。SDS前處理法和SAP前處理法鑒定念珠菌至種水平的準(zhǔn)確率分別為72.7%和63.6%，較腸桿菌科和葡萄球菌低，可能與念珠菌繁殖速度慢，1 mL血培養(yǎng)樣本中收集的菌量少，且念珠菌的細(xì)胞壁較厚，甲酸裂解效果較差有關(guān)[11]。若發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本涂片結(jié)果為真菌孢子，建議適當(dāng)增加血培養(yǎng)樣本的抽取量，然后加入SDS或SAP進(jìn)行裂解，再離心富集細(xì)菌進(jìn)行MALDI-TOF MS檢測(cè)，從而提高鑒定準(zhǔn)確率。

采用SDS和SAP前處理法聯(lián)合MALDI-TOF MS對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本進(jìn)行鑒定，操作簡(jiǎn)便，成本較低，可以快速、準(zhǔn)確地得到初步鑒定結(jié)果；特別是SDS前處理法，鑒定效果優(yōu)于SAP前處理法、分離膠法和商品化試劑盒，可以在臨床微生物實(shí)驗(yàn)室廣泛開(kāi)展。對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)樣本進(jìn)行直接病原菌鑒定，可以快速、準(zhǔn)確地向臨床報(bào)告引起血流感染的菌種，為臨床經(jīng)驗(yàn)性抗感染治療提供有效的依據(jù)。