余曉東　張鵬　宋發(fā)軍　劉佳　席曉圓　于鵬飛

摘要：研究重樓種子外種皮提取物有機酸、生物堿、酚類對水稻種子萌發(fā)的影響。分別采用堿提酸沉法、酸提法、乙醇浸提法提取重樓種子外種皮中的有機酸、生物堿、酚類，梯度稀釋后處理水稻種子，分析提取物對水稻種子48 h的萌發(fā)率、第10天對苗高、鮮質(zhì)量以及胚根長的影響。以蒸餾水（CK）作對照。試驗結(jié)果，3類提取物與CK相比，在2.5～50.0 mg/mL的處理濃度范圍內(nèi)對水稻種子48 h的萌發(fā)率、第10天的苗高、鮮質(zhì)量、胚根長都有抑制作用。在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內(nèi)，3類提取物對種子萌發(fā)率的抑制作用相差不大，對苗高、鮮質(zhì)量抑制作用的強弱順序依次是酚類>生物堿>有機酸，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內(nèi)，3類提取物對種子萌發(fā)率、苗高、鮮質(zhì)量的抑制作用的強弱順序依次為：生物堿>酚類>有機酸。此外，還發(fā)現(xiàn)每類提取物對胚根長度的抑制作用要強于對其他指標(biāo)的抑制，且在整個處理濃度范圍內(nèi)抑制作用的強弱順序是：生物堿>酚類>有機酸。通過研究明確了3類物質(zhì)對種子萌發(fā)抑制作用的效果，確定了有機酸、生物堿、酚類是存在于重樓種子外種皮中的3類萌發(fā)抑制物，研究結(jié)果為深入研究重樓種子的休眠機制提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：重樓種子；外種皮；有機酸；生物堿；酚類；萌發(fā)

中圖分類號：Q945.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0096—03

重樓又名七葉一枝花，為百合科重樓屬重要藥用植物。重樓種子休眠程度高，自然條件下需要兩冬一夏才能萌發(fā)，且萌發(fā)率低。種皮吸水障礙、胚休眠和種子中存在抑制類物質(zhì)是種子休眠的三大原因。常見的萌發(fā)抑制物有有機酸、生物堿、酚類、醛類、不飽和內(nèi)酯、脫落酸、芳香油、芥子油、氣體物質(zhì)等。滇重樓的外種皮肉質(zhì)多汁，櫻紅色，具有角質(zhì)層，在維持種子休眠中起著重要作用，然而重樓種子外種皮中是否存在萌發(fā)抑制物卻鮮有報道。本研究采用堿提酸沉法、酸提法、乙醇浸提法提取重樓種子外種皮中的有機酸、生物堿、酚類物質(zhì)，并研究3類物質(zhì)對水稻種子萌發(fā)的影響，以期確定外種皮中是否存在萌發(fā)抑制物，為深入研究重樓種子的休眠機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 重樓外種皮：2013年9—10月于湖北省恩施州巴東縣采集重樓種子后，脫去外種皮，并將其烘干至恒重備用。

1.1.2試劑 飽和鹽酸乙醚、碳酸氫鈉、無水乙醇、冰乙酸、濃鹽酸、乙酸乙酯，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 JP-150A型高速多功能粉碎機，永康市久品工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；RK1028型超聲波清洗機，BANDELINSONOREX SUPER；5810R型臺式大容量冷凍離心機，德國Eppendorf公司生產(chǎn)；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1 3類物質(zhì)提取與梯度稀釋 有機酸、生物堿、酚類的提取分別采用堿提酸沉法、酸水提取法、乙醇浸提法。3種提取液母液濃度均為50 mg/mL。準(zhǔn)確稱取10 g外種皮粉末，按上述方法提取，將得到的3種提取液蒸干后再用蒸餾水定容至200 mL，并分別按2、5、10、20倍進(jìn)行稀釋，得到濃度分別為25.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的梯度稀釋液。

1.2.2浸種及培養(yǎng) 水稻種子在37℃條件下浸種12 h后置于鋪有雙層紗布的培養(yǎng)皿中，每皿50粒種子，并分別用10 mL 5種濃度的3種提取液處理水稻種子，蒸餾水作對照（CK），每個處理3次重復(fù)。室溫培養(yǎng)10 d，培養(yǎng)過程中根據(jù)皿中種子的干濕情況，加入2～5 mL處理液。

1.2.3指標(biāo)測定浸種48 h開始統(tǒng)計水稻種子萌發(fā)率，第10天測定水稻幼苗苗高、鮮質(zhì)量、胚根長度，并按[相對抑制率=1-處N/對照]×100%，計算提取物對水稻幼苗胚根長的相對抑制作用。

1.3統(tǒng)計分析

采用Excel 2003和SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1提取物對水稻種子萌發(fā)率的影響

3類提取物對水稻種子萌發(fā)都有一定的影響，并隨著濃度增加，對水稻種子萌發(fā)的抑制作用逐漸增強（圖1）。與對照相比，2.5 mg/mL的有機酸對水稻種子萌發(fā)的抑制作用不明顯，5～25 mg/mL的有機酸對水稻種子萌發(fā)的抑制作用顯著，但各個濃度間差異不明顯，而50 mg/mL的有機酸對水稻種子萌發(fā)的抑制作用更強，萌發(fā)率與對照相比降低了15%。生物堿在2.5～50.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度增加，對水稻種子萌發(fā)的抑制作用逐漸增強，且抑制作用極顯著，而當(dāng)濃度為25、50 mg/mL時，水稻種子已不再萌發(fā)。酚類提取物在2.5～10.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對水稻種子萌發(fā)無明顯影響，而在25～50 mg/mL時對水稻種子萌發(fā)的抑制作用極顯著，萌發(fā)率迅速降低。結(jié)果表明，在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內(nèi)，3類提取物對水稻種子萌發(fā)的抑制作用相差不大，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內(nèi)，生物堿的抑制作用最強，酚類次之，有機酸最弱。

2.2提取物對水稻幼苗苗高和鮮質(zhì)量的影響

提取物對水稻幼苗苗高和鮮質(zhì)量的影響見圖2、圖3。與對照相比，2.5～10.0 mg/mL的有機酸對苗高、鮮質(zhì)量的影響不明顯，但在25～50 mg/mL時，有機酸對苗高、鮮質(zhì)量的抑制作用極顯著，當(dāng)濃度為50 mg/mL時，水稻苗高、鮮質(zhì)量分別下降了69.4%、21.4%。生物堿在2.5～50.0 mg/mL對苗高、鮮質(zhì)量的抑制作用均為極顯著，且抑制作用隨著濃度的升高而增強，與對水稻種子萌發(fā)率的抑制效果相吻合。酚類在2.5～25.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)對苗高、鮮質(zhì)量的抑制極顯著，但不同濃度間差異不顯著，而當(dāng)濃度增至50 m/mL時，其抑制作用達(dá)到最強，苗高、鮮質(zhì)量分別降低了77.9%、31.2%。與對水稻種子萌發(fā)率的抑制不同的是，在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內(nèi)，3類提取物對苗高、鮮質(zhì)量抑制作用的強弱順序依次是酚類>生物堿>有機酸，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內(nèi)，抑制作用的強弱順序依次是生物堿>酚類>有機酸。

2.3提取物對水稻幼苗胚根生長的影響

3類提取物對幼苗胚根長的抑制最為明顯，且隨著濃度增大，抑制作用逐漸增強（圖4）。當(dāng)有機酸、生物堿、酚類3類提取物的濃度均為2.5 mg/mL時，它們對胚根長的相對抑制率分別為2.5%、88.2%、75.2%，而當(dāng)濃度升為50 mg/mL，相對抑制率竟高達(dá)70.9%、100.0%、99.7%（圖5）。綜上所述，抑制作用的強弱順序是生物堿>酚類>有機酸。3類提取物對種子萌發(fā)及幼苗生長的影響見圖6。

3討論

研究表明，種胚發(fā)育不完全，種子中存在萌發(fā)抑制物是重樓種子休眠的主要原因。古今等發(fā)現(xiàn)滇重樓種皮和種子中均存在著一定活性的抑制物質(zhì)，且抑制物質(zhì)的活性隨著提取液濃度的增加而增加，種子是抑制物質(zhì)存在的主要部位，抑制物的活性比種皮中的明顯。黃瑋等研究發(fā)現(xiàn)，滇重樓種子的萌發(fā)抑制物質(zhì)只存在于種子中，外種皮中并無萌發(fā)抑制物的存在，外種皮的抑制作用可能是疏水的外種皮阻止了萌發(fā)抑制物質(zhì)的溢出。與上述研究結(jié)論不同的是，王躍華等研究發(fā)現(xiàn)，華重樓種子外種皮的水提液對青菜、榨菜、白菜3種植物種子的萌發(fā)以及幼苗生長都具有明顯抑制作用。因此，外種皮中是否存在萌發(fā)抑制物及含有的萌發(fā)抑制物類型需要進(jìn)行深入研究。

本研究結(jié)果，3類提取物在2.5～50 mg/mL的處理濃度范圍內(nèi)對水稻種子萌發(fā)率、苗高、鮮質(zhì)量、胚根長都有抑制作用，且隨著濃度增大，抑制作用逐漸增強。在2.5～5.0 mg/mL的低濃度范圍內(nèi)，3類提取物對種子萌發(fā)率的抑制作用相差不大，對苗高和鮮質(zhì)量抑制作用強弱順序依次是酚類>生物堿>有機酸，而在10～50 mg/mL的高濃度范圍內(nèi)，3類提取物對種子萌發(fā)率、苗高、鮮質(zhì)量的抑制作用的強弱順序依次為：生物堿>酚類>有機酸。3類提取物對胚根長的抑制作用要強于對其他指標(biāo)的抑制，在整個處理濃度范圍內(nèi)抑制作用的強弱順序依次為：生物堿>酚類>有機酸。

Cruz-Chacon等發(fā)現(xiàn)，當(dāng)異葉番荔枝種子吸脹和萌發(fā)時，與芐基異喹啉生物堿合成有關(guān)的4種酶在發(fā)育的胚中均被監(jiān)測到存在激活現(xiàn)象，而胚乳中并無酶活力，表明生物堿的合成與胚的早期生長發(fā)育密切相關(guān)。Muscolo等發(fā)現(xiàn)，從2種不同植被的森林土壤中提取的酚類物質(zhì)對自拉瑞斯歐松樹種子萌發(fā)均存在抑制作用，而這些種子未萌發(fā)和糖酵解及磷酸戊糖途徑中所涉及到的酶的活力受到抑制強烈相關(guān)。姚軍等發(fā)現(xiàn)，鄰苯二甲酸、苯甲酸和肉桂酸均抑制了加工番茄不同品種種子的萌發(fā)，表現(xiàn)在萌發(fā)率、胚根長較對照均有顯著降低，而且隨有機酸濃度的增加，這種抑制程度也逐漸增強。本研究分析了重樓外種皮中有機酸、生物堿、酚類對水稻種子萌發(fā)的影響，比較其對種子萌發(fā)及幼苗生長抑制作用的強弱，最終確定了重樓外種皮中存在這3類萌發(fā)抑制物。研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明重樓外種皮中萌發(fā)抑制物的類型、深入研究重樓種子的休眠機制提供理論依據(jù)。