劉慧，陳勝玲，徐建中*，張偉國*

1(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

倍半萜類化合物在醫(yī)藥、化妝品、調(diào)味品和生物能源方面具有巨大的經(jīng)濟價值[1-2]。法尼烯是植物產(chǎn)生的最簡單的無環(huán)倍半萜之一，在蘋果皮中分布豐富[3]。但是，它的天然合成受到植物生長的嚴重限制，無法滿足市場需求[4]。因此，研究人員已經(jīng)努力設計微生物細胞工廠以生產(chǎn)法尼烯[5-9]。最近，已經(jīng)在大腸桿菌[5]、釀酒酵母[6]和解脂耶氏酵母[7-9]中通過設計代謝工程來生產(chǎn)法尼烯。與這些宿主相比，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)成本低、周期短、表達量高且可高密度培養(yǎng)，具有大規(guī)模生產(chǎn)α-法尼烯的潛力。一些研究已經(jīng)證明，巴斯德畢赤酵母是生產(chǎn)類異戊二烯的合適宿主[10]。然而，目前沒有報道描述巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯的異源生產(chǎn)。

在本項研究中，首先成功構(gòu)建了產(chǎn)α-法尼烯的巴斯德畢赤酵母重組菌株。然后揭示了巴斯德畢赤酵母甲羥戊酸途徑和α-法尼烯合成途徑中限速步驟。之后對限速酶組合過表達并優(yōu)化基因拷貝數(shù)以平衡代謝途徑逐步提高α-法尼烯產(chǎn)量。最后通過外源添加不飽和脂肪酸促進α-法尼烯分泌到細胞外，在搖瓶中最終獲得α-法尼烯產(chǎn)量約1.40 g/L[0.32 g/g 細胞干重(dry cell weight，DCW)]。這些策略提供了增強巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯生產(chǎn)的有效方法，并為其他增值化學品的生物生產(chǎn)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

釀酒酵母S288C、大腸桿菌DH5α、野生型巴斯德畢赤酵母X33、大腸桿菌-酵母穿梭質(zhì)粒PGAPZA，購自Invitrogen。

1.2 試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶，Thermo Scientific；TaqDNA聚合酶、DNA Marker、DNA切膠回收試劑盒、T4DNA連接酶，TaKaRa；PCR引物、質(zhì)粒快速提取試劑盒，上海生工；酵母基因組提取試劑盒，康為世紀；博來霉素、遺傳霉素，Invitrogen；標準品β-法尼烯、玻璃珠，Sigma；正十二烷，羅恩試劑；油酸、硬脂酸、棕櫚酸、亞麻酸、亞油酸、棕櫚油酸均為國藥分析純。

臺式高速冷凍離心機，德國Sigma公司；真空冷凍干燥機，日本Toshiba公司；高效氣相色譜儀，日本Shimadzu公司；電脈沖基因轉(zhuǎn)移儀，美國BIO-RAD公司。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化鈉5；YPD培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10；BMDY培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏10，YNB 13.4，生物素0.5，磷酸鉀緩沖液100 mmol/L (pH 6.0)。

1.4 重組質(zhì)粒以及菌株的構(gòu)建

表1和表2列出了該研究中使用的巴斯德畢赤酵母重組菌株和質(zhì)粒。利用GENEWIZ對來自蘋果(Malusdomestica)的α-法尼烯合成酶(α-farnesene synzyme，AFS)基因(Gene ID：103446592)進行了密碼子優(yōu)化和合成。所有酶表達載體均基于PGAPZA載體插入了相應表達基因。ERG10，ERG13，ERG12，ERG8，ERG19，IDI1，ERG20分別從巴斯德畢赤酵母X33基因組中擴增相應基因。tHmg1從釀酒酵母S288C中擴增被截短的HMG1(Gene ID：854900)。AFSLERG20是AFS和ERG20的融合基因，兩個基因之間用GSG 3個氨基酸連接。重組質(zhì)粒通過使用AvrII酶切線性化然后將其整合到巴斯德畢赤酵母X33基因組上。

表1 本研究使用的菌株Table 1 The strains used in this study

表2 本研究中使用的質(zhì)粒Table 2 The plasmids used in this study

1.5 巴斯德畢赤酵母的轉(zhuǎn)化和篩選

按照JOAN等[11]的方法進行巴斯德畢赤酵母感受態(tài)細胞的制備和電穿孔。30 ℃、90 r/min復蘇1 h，涂在含有100 mg/L博來霉素或者400 mg/L遺傳霉素G418的YPD板上以篩選重組菌落。使用酵母基因組提取試劑盒提取酵母基因組，并通過PCR驗證基因整合到基因組中。

1.6 細胞干重測定

取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心棄上清液，用清水洗滌2次后于烘箱中90 ℃烘干至恒重,得到菌體干重。

1.7 α-法尼烯含量的測定

按照LIU等[9]的方法進行α-法尼烯含量的測定。收集兩相培養(yǎng)物的上層有機相，并以12 000 r/min離心10 min以去除細胞碎片，然后使用日本Shimadzu GC-2010 Plus配備有火焰離子化檢測器的氣相色譜儀，以1∶20的分流比進樣，并在db-17色譜柱(30.0 m×0.32 mm，0.25 μm)上分離出1 μL樣品?？鞠錅囟茸畛踉?0 ℃下保持1 min，然后以15 ℃/min的速度升至245 ℃保持1.5 min，以相同的速度升溫至280 ℃后運行時間為5 min。氦氣用作載氣，入口壓力為96 kPa。探測器溫度保持在250 ℃。通過比較樣品和β-法尼烯標準品的峰面積進行定量分析。

1.8 重組畢赤酵母搖瓶培養(yǎng)

將重組菌接種于10 mL YPD培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min 下培養(yǎng)17 h作為種子液。以10%接種量接種于50 mL BMDY培養(yǎng)基的500 mL搖瓶進行搖瓶培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)基中添加體積分數(shù)為10%正十二烷來收集α-法尼烯。不飽和脂肪酸包括油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚油酸(均為液態(tài))，直接加入培養(yǎng)基中。飽和脂肪酸包括硬脂酸和棕櫚酸(均為固體顆粒)，為保證其在培養(yǎng)基中能夠均勻地分散，將其溶于200 μL無水乙醇后進行添加，因此對于飽和脂肪酸，對照組應加入200 μL的乙醇。每組試驗設置3個平行，分別測定α-法尼烯產(chǎn)量和菌體干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯生物合成途徑的構(gòu)建

通過GENEWIZ對來源于蘋果的法尼烯合成酶基因(AFS)進行了密碼子優(yōu)化和合成。構(gòu)建了組成型表達質(zhì)粒PGAPZA-AFS，通過AvrII將其線性化并整合到巴斯德畢赤酵母的基因組中從而獲得重組菌株F1。僅使用少量線性化質(zhì)粒(500 ng/80 mL 細胞)來確保單拷貝整合的通用性[12]。將重組菌株在BMDY培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，其中分別覆蓋體積分數(shù)為10%的十二烷以收獲產(chǎn)物。GC/GC-MS分析表明(圖1)，在菌株F1中觀察到法尼烯產(chǎn)量為(451.13±18.92) mg/L。先前的研究表明，來源于蘋果的α-法尼烯合成酶在大腸桿菌中α-法尼烯的產(chǎn)量為1.56 mg/L[3]，在釀酒酵母中為4 mg/L[20]，在解脂耶氏酵母中為0.13 g/L[9]。研究結(jié)果表明，重組畢赤酵母中α-法尼烯的產(chǎn)量是遠高于其他宿主。這可能是與巴斯德畢赤酵母外源蛋白表達水平高，高密度培養(yǎng)特性有關(guān)[21]。此外，菌株之間的生產(chǎn)能力差異很大也突出了巴斯德畢赤酵母合成α-法尼烯的優(yōu)越性。

a-氣相色譜圖；b-質(zhì)譜圖圖1 重組菌株F1合成的α-法尼烯氣相色譜以及質(zhì)譜圖Fig.1 GC/GC-MS of α-farnesene synthesized by recombinant strain F1

2.2 揭示甲羥戊酸途徑和α-法尼烯合成途徑中的限速步驟

截短的HMG1(tHmg1)基因可以有效解除膽固醇合成途徑中麥角固醇等的反饋抑制[13]，過表達tHmg1通常認為是有益于類異戊二烯在酵母中生產(chǎn)[14]。為了改善α-法尼烯在畢赤酵母中的生物合成，在菌株F1基礎(chǔ)上成功地過表達tHmg1得到菌株F2。菌株F2顯示α-法尼烯的產(chǎn)量達到(0.53±0.01) g/L，比F1中觀察到的產(chǎn)物水平提高約18%。

研究表明，tHmg1與甲羥戊酸(mevalonate ，MVA)途徑以及α-法尼烯合成途徑其他基因的共過量表達可能會使α-法尼烯的產(chǎn)量進一步提高[15]。在此，將tHmg1分別與MVA途徑與α-法尼烯途徑(圖2)中涉及到的8個基因ERG10、ERG13、ERG12、ERG8、ERG19、IDI1、ERG20、AFSLERG20進行組合過表達(圖3)，并探究對α-法尼烯合成的影響，從而確定了限速步驟。所有的基因都整合到畢赤酵母的基因組中，并以強組成型啟動子PGAP表達。與菌株F2相比，菌株F7、F8、F10、F11的α-法尼烯濃度增加了約37.13%～55.24%(圖3)。在F10/F11中，tHmg1和AFSLERG20組合過表達顯示最高的α-法尼烯產(chǎn)量為(0.70±0.03) g/L，其次是tHmg1和IDI1/ERG19組合過表達。然而，F(xiàn)11是在F10中額外過表達AFS，幾乎沒有增加α-法尼烯的產(chǎn)生，說明此時AFS可能不是α-法尼烯合成途徑中的限速基因。同時tHmg1與ERG8/ERG10/ERG12/ERG13/ERG20基因的過表達導致α-法尼烯產(chǎn)量僅產(chǎn)生細微的變化(圖3)，可能是由于過表達導致中間體的積累和途徑不平衡[7,16]。結(jié)果表明，tHmg1，IDI1，ERG19，AFSLERG20是MVA途徑和α-法尼烯合成途徑的限速酶基因，過表達后可改善巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯的合成。

圖2 α-法尼烯的生物合成途徑Fig.2 The biosynthetic pathway of α-farnesene注：二甲基烯丙基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP)，異戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)，牻牛兒焦磷酸(geranyl pyrophosphate，GPP)，法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate，F(xiàn)PP)

圖3 tHmg1與MVA途徑和α-法尼烯合成途徑基因分別組合過表達對巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯產(chǎn)生的影響Fig.3 Effect of overexpression of tHmg1 in combination with genes of the mevalonate pathway and α-farnesene synthesis pathway on the production of α-farnesene in P.pastoris注：“+”代表包含對應的基因；“-”代表不包含對應的基因(下同)

2.3 過表達甲羥戊酸途徑以及α-法尼烯合成途徑限速酶促進α-法尼烯的合成

結(jié)果表明，tHmg1與AFSLERG20組合過表達對系統(tǒng)的貢獻最大，其次是tHmg1與IDI1/ERG19?；谶@些結(jié)果，選擇了tHmg1，IDI1，ERG19和AFSLERG20這4個關(guān)鍵酶基因，通過3個或者3個以上組合過表達嘗試進一步提高菌株中α-法尼烯的產(chǎn)量。在菌株F12中，tHmg1，IDI1和AFSLERG20的組合過表達，α-法尼烯的產(chǎn)量與菌株F10相比分別提高約25.96%(圖4)。有趣的是，菌株F13中tHmg1，ERG19和AFSLERG20組合過表達與對照菌株F10相比，α-法尼烯產(chǎn)量反而降低約18.57%(圖4)。菌株F13是在F10的基礎(chǔ)上過表達ERG19，推測可能是由于F13具有更高水平的ERG19酶的表達以造成有毒中間體IPP的積累，從而導致α-法尼烯產(chǎn)量降低[5]。

異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(由IDI1基因編碼)催化IPP向DMAPP的異構(gòu)化，并在GPP和FPP通量的分布中起關(guān)鍵作用[15]。為了驗證猜想，通過在菌株F13引入1～2個拷貝IDI1基因，分別產(chǎn)生菌株F14和F15。菌株F14和F15的α-法尼烯產(chǎn)量達到約1.00 g/L，這暗示著平衡IPP和DMAPP池可能在增強倍半萜生物合成的碳通量中起重要作用。除此之外，構(gòu)建了菌株F16，在F15基礎(chǔ)上額外過表達1個拷貝AFSLERG20，α-法尼烯產(chǎn)量進一步提高，如圖4所示，達到(1.09±0.02) g/L(菌株F1的2.42倍)。上述一系列組合的結(jié)果表明，優(yōu)化MVA途徑限速酶基因的組合表達可以有效地促進畢赤酵母中倍半萜的異源生物合成。同時也揭示了在微生物宿主中建立高效的萜類化合物途徑，必須小心平衡途徑中上下游代謝通量以避免有毒中間代謝物的積累。

圖4 限速酶基因組合過表達以及基因拷貝數(shù)優(yōu)化對巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯產(chǎn)生的影響Fig.4 Effects of rate-limiting enzyme gene combination overexpression and gene copy number optimization on the production of α-farnesene in P.pastoris

2.4 添加不飽和脂肪酸促進α-法尼烯的分泌

小分子的萜類化合物，例如倍半萜和類黃酮，通常被分泌到細胞外[6]。然而，有限的細胞膜通透性是倍半萜分泌的障礙[6]。各項研究表明，增大不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acid，UFA)/飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)的比例有助于增加有毒物質(zhì)跨膜的膜通透性[6, 17-19]。同時，酵母細胞可以很容易地從培養(yǎng)基中吸收外源UFA和SFA，并迅速整合到膜脂質(zhì)中[19]。因此，通過向菌株F16培養(yǎng)基中外源添加脂肪酸，來試圖提高巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯的產(chǎn)量。最初添加了10 mmol/L不飽和脂肪酸油酸(C18∶1)、亞油酸(C18∶2)、亞麻酸(C18∶3)、棕櫚油酸(C16∶1)、飽和脂肪酸硬脂酸(C18∶0)和棕櫚酸(C16∶0)于菌株F16的培養(yǎng)基中，首先確定了不同脂肪酸對重組菌株的α-法尼烯產(chǎn)量以及對細胞生長的影響。如圖5所示，除了亞油酸，其他不飽和脂肪酸對α-法尼烯產(chǎn)量的提高均有積極影響，其中油酸的積極作用尤為顯著。之前的研究[19]和本研究都觀察到添加飽和脂肪酸對異戊二烯產(chǎn)量的增加并沒有積極影響。脂肪酸的添加可以促進菌體的生長，這種促進作用僅存在于3種不飽和脂肪酸中，飽和脂肪酸對菌體生長均沒有促進作用(圖5)。此外，亞油酸雖然對菌體生長有積極作用，然而對MVA途徑似乎沒有促進作用，這可能歸因于菌體對脂肪酸的利用有偏好性和菌株對不飽和脂肪酸氧化壓力的耐受能力不同[19]。因此選擇油酸來促進α-法尼烯的分泌。為了最大程度地提高畢赤酵母中α-法尼烯的產(chǎn)量，優(yōu)化了油酸添加濃度。如圖6所示，確定向細胞提供20 mmol/L的油酸獲得最佳的α-法尼烯產(chǎn)量約為1.40 g/L，收率約為0.07 g/g，生產(chǎn)率約為0.019 g/(L·h)。α-法尼烯產(chǎn)量是出發(fā)菌株F1的3.1倍。

圖5 外源添加不同脂肪酸對巴斯德畢赤酵母中α-法尼烯合成的影響Fig.5 The effect of different fatty acids on the synthesis of α-farnesene in P.pastoris

圖6 外源添加油酸的最適濃度Fig.6 Optimal concentration of oleic acid

3 結(jié)論與討論

本研究是首次以發(fā)酵周期短，易高密度培養(yǎng)特性的巴斯德畢赤酵母作為底盤微生物細胞來生產(chǎn)α-法尼烯，揭示了MVA途徑和α-法尼烯合成途徑中限速步驟，對限速酶組合過表達并優(yōu)化基因拷貝數(shù)以平衡代謝途徑逐步提高α-法尼烯產(chǎn)量，最后通過外源添加不飽和脂肪酸促進α-法尼烯分泌到細胞外，在搖瓶中菌株F16最終獲得α-法尼烯產(chǎn)量約1.40 g/L(0.32 g/g DCW)，生產(chǎn)率約為0.019 g/(L·h)。在搖瓶水平上，菌株F16的α-法尼烯生產(chǎn)率是解脂耶氏酵母[9]的1.38倍，大腸桿菌[3]的2.4倍，釀酒酵母[22]的3.8倍。盡管巴斯德畢赤酵母工程菌中α-法尼烯產(chǎn)量顯著提高，但是競爭途徑[13]以及代謝串擾[23]仍然是阻止目標化合物有效合成的障礙。因此，減弱競爭途徑和代謝串擾將是未來努力的方向?？傊?，以巴斯德畢赤酵母作為底盤微生物生產(chǎn)α-法尼烯是非常有前景的，為大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)α-法尼烯提供新的希望。