李琳瓊，洪 靜，張麗君，高瑀瓏*

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

沙門氏菌屬是食品中常見的致病菌，在自然界分布廣泛，由其引起的食品中毒事件數(shù)量在食品中毒事件中常居首位[1]。食源沙門氏菌的爆發(fā)將對食品工業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重威脅消費者的安全。在食品的生產(chǎn)、加工以及儲藏過程中，沙門氏菌常常會遭受酸、堿、溫度、滲透壓以及消毒劑等一系列不適環(huán)境的脅迫作用，誘發(fā)其產(chǎn)生脅迫應激反應來提高存活率[2]。食品工業(yè)中常采用各種滅菌方法來保證食品的微生物安全，其中利用有機酸來殺菌，因其溫和性、有效性及實用性等優(yōu)點，能夠滿足當前消費者對食品天然、新鮮、微加工及少添加劑等消費需求，且由于其工業(yè)化應用的易操作性和有效的滅菌效果，備受消費者青睞，在食品工廠中已被廣泛應用[3]。

微生物的耐酸性不僅受到遺傳因素的影響，還受到環(huán)境因素的影響[4]。微生物對不良環(huán)境因素產(chǎn)生抗性或適應性反應的機制，一直是微生物研究熱點，然而，微生物對不適生存環(huán)境產(chǎn)生抗性或適應性反應機制目前尚未研究清楚[5-6]，深入系統(tǒng)地研究食源性致病菌在食品加工環(huán)境中的酸脅迫響應機制，以期為有機酸殺菌技術在食品工業(yè)中的廣泛應用奠定理論基礎。Fernández等[7]研究發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌在經(jīng)有機酸調節(jié)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，再置于70 ℃的高溫下處理，與對照菌株相比其D值明顯增加，說明酸適應性菌株對高溫環(huán)境產(chǎn)生了抗性。Koutsoumanis等[8]將單增李斯特菌置于亞致死的弱酸中處理一段時間，發(fā)現(xiàn)其對強酸致死的抵抗作用提高。Yang Yishan等[9]認為，微生物對不良環(huán)境產(chǎn)生的抗性與細胞膜流動性之間具有一定的相關性，而微生物細胞膜脂質的變化顯著影響細胞膜的流動性。細菌細胞膜是由磷脂雙分子層與蛋白質構成的富有彈性的半透性薄膜。流動的脂質雙分子層是生物膜結構的基本特征，適宜的流動性是保證細胞進行正常生理功能的重要條件[10]。 Liu Zhiwei等[11]研究表明，細胞膜的磷脂組成及其結構一般會影響微生物細胞膜的流動性。Chen Mingju等[12]研究發(fā)現(xiàn)，微生物處于高溫、低溫、酸和膽鹽等壓力環(huán)境下其蛋白的表達會發(fā)生相應的變化，起到穩(wěn)定膜結構、維持細胞功能的作用。大多數(shù)微生物在不適生長的環(huán)境中會產(chǎn)生應激反應[13]。目前國內(nèi)外關于沙門氏菌抗酸性及其機制的研究不多見。李琳瓊等[14]研究發(fā)現(xiàn)檸檬酸、乳酸、醋酸和蘋果酸4 種有機酸脅迫均可誘導鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190抗酸性增加，其中檸檬酸誘導能力最強。本研究以檸檬酸作為脅迫因素對鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190進行多次脅迫處理，研究其抗酸性變化及其機制，然而迄今對微生物進行多次酸環(huán)境條件脅迫研究其抗性及其適應性反應的機制尚不清楚[15]。 本實驗以食品生產(chǎn)加工中常見的鼠傷寒沙門氏菌為研究對象，研究酸脅迫作用下其抗酸性的變化及其與形態(tài)、細胞膜通透性、流動性以及膜蛋白表達的關系，旨在綜合分析酸脅迫誘導鼠傷寒沙門氏菌產(chǎn)生抗酸性的變化及其機制，對優(yōu)化食品加工條件、加強食品安全預測及控制體系建立具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）CGMCC 1.1190（簡稱CGMCC 1.1190），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

檸檬酸、氯化鈉、氫氧化鈉、氯化鎂、鹽酸、氯仿、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、戊二醛、乙醇、冰乙酸、 甲醇，均為分析純；胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（trypticase soy agar，TSA）培養(yǎng)基 吳江康寧生命科學有限公司；LIVE/DEAD BacLightTM細菌活性試劑盒、400 目尼龍篩網(wǎng)、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒、96 孔微量酶標板、彩虹180廣譜蛋白Marker、TritionΧ-114、質量分數(shù)30%聚丙烯酰胺制膠液、5×蛋白質上樣緩沖液、過硫酸銨、考馬斯亮藍R250 南京丁貝生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LDZΧ-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；GNP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱、SF-CF-2A型超凈工作臺 上海三發(fā)科學儀器有限公司；PHS-3G型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海市離心機械研究所有限公司； EVO-LS10型掃描電子顯微鏡、A1正置熒光顯微鏡 德國ZEISS公司；K850型臨界點干燥儀 英國QUORUM公司；108AUTO鍍金儀 英國CRESSINGTON公司；FACSVerse型流式細胞儀 美國BD公司；DSC-8000差示掃描量熱儀 美國珀金埃爾默股份有限公司；ZF-258凝膠成像系統(tǒng) 上海金鵬分析儀器有限公司；JY-SCZ2+電泳儀 北京君意東方電泳設備有限公司；HZQ-F160型恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實驗設備廠；ME55型塞多斯精密電子天平 北京塞多斯天平有限公司；SK-1型快速混勻器 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與預處理

實驗菌株CGMCC 1.1190經(jīng)活化后，接入pH 7.2的TSB培養(yǎng)基，于37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h后以1%（體積分數(shù)，后同）的接種量轉接至150 mL新鮮的TSB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，菌體濃度約為1.0×108CFU/mL。

1.3.2 酸脅迫處理鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190

pH 3.0、2.7、2.5、2.0的TSB培養(yǎng)基的配制：以0.05 mol/L檸檬酸調節(jié)TSB培養(yǎng)基的pH值分別為3.0、2.7、2.5和2.0，滅菌備用。

CGMCC 1.1190的酸脅迫處理及其培養(yǎng)：分別取10 mL 1.3.1節(jié)活化后的CGMCC 1.1190培養(yǎng)液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄上清液，重懸于等體積的pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中進行酸脅迫處理，37 ℃處理30 min，分別按接種量1.5%、1.8%、2.0%將各個酸度脅迫處理后的CGMCC 1.1190菌種分別接種于100 mL TSB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h，再分別取10 mL培養(yǎng)液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于等體積的pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中進行酸脅迫處理，37 ℃下處理30 min；以此類推，重復上述搖床振蕩培養(yǎng)和酸脅迫處理共12 次后備用。

CGMCC 1.1190抗酸菌株的獲得：取上述pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中反復脅迫培養(yǎng)處理12 次的CGMCC 1.1190培養(yǎng)液100 mL，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，用質量分數(shù)0.85%生理鹽水洗滌1 次，重懸于等體積的生理鹽水，調整菌懸液濃度為107CFU/mL，并將其分裝在于10 mL的無菌離心管備用。

1.3.3 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190抗酸性參數(shù)D值的測定

D值表示在一定的致死條件下殺死某種細菌數(shù)量的90%所需要的時間。D值越大，表明細菌對致死條件的抗性越強[16]。

分別測定1.3.2節(jié)中每次、每種pH值條件下酸處理5、10、15、20、25、30 min時的CGMCC 1.1190存活量，在TSA平板上按文獻方法進行菌落計數(shù)[17]，共6 個時間點，以酸處理的時間為橫坐標，菌體存活量為縱坐標，對此 6 個時間點進行線性回歸分析，所得線性回歸方程的斜率的負倒數(shù)即為D值，分別測得CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5 TSB培養(yǎng)基中的D3.0、D2.7、D2.5，以線形回歸方程的決定系數(shù)R2來評價D值擬合優(yōu)度。不同pH值作用下，按照下式計算D值。

式中：D值表示在一定pH值作用下使CGMCC 1.1190的數(shù)量降低1 個對數(shù)單位所需的時間/min；t為酸處理時間/min；N0、Nt分別表示初始和酸處理t時間之后存活的CGMCC 1.1190菌的數(shù)量。

1.3.4 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190個體形態(tài)的觀察

對1.3.1節(jié)的原始對照菌株和1.3.2節(jié)得到的抗酸性CGMCC 1.1190菌株在TSA平板上培養(yǎng)48 h后，直接觀察CGMCC 1.1190的菌落形態(tài)；以無菌接種環(huán)挑取單菌落，用結晶紫和碘液進行簡單染色，在光學顯微鏡下觀察CGMCC 1.1190個體形態(tài)。

采用掃描電子顯微鏡對CGMCC 1.1190個體形態(tài)的觀察參照李小媚等[18]的方法，并做適當修改。將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分數(shù)1%分別接種于裝有100 mL TSB培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，離心（4 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，以生理鹽水洗滌2 次；加入質量分數(shù)2.5%戊二醛浸沒菌體，振蕩3～5 min，使菌體與固定液充分接觸，室溫固定5 h，離心（4 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，加入緩沖液A（10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液， pH值7.2～7.4），振蕩5 min，離心（4 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，重復2 次；將離心管中的4 株菌株依次用體積分數(shù)30%、50%、70%、80%、90%、95%的乙醇溶液離心（25 ℃、5 000 r/min，15 min），棄去上清液，并重懸于無水乙醇中，靜置10 min；分別取10 μL上述樣品放置于蓋玻片上，采用臨界點干燥儀進行干燥，將其固定在載物臺上，置于鍍金儀中真空噴金90 s，用掃描電子顯微鏡拍照。掃描電子顯微鏡使用的電壓為10 kV，在放大10 000 倍視野下進行觀察。

1.3.5 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190 菌體細胞膜 通透性的測定

細菌細胞膜通透性測定原理參見文獻[19]。SYTO9是一種綠色熒光核酸染料，可以穿過細胞壁和細胞膜與DNA結合；碘化丙啶（propidium iodide，PI）是一種紅色熒光核酸染料，只能穿過不完整的細胞壁、細胞膜，兩種染料共同使用可以指示細菌細胞膜通透性的變化。當同時用SYTO9和PI進行染色（SYTO9/PI雙染）的時候，PI染料會削弱SYTO9的熒光強度，在死亡細胞中，PI染料可以取代SYTO9染料與核酸結合。當采用流式細胞儀對細菌懸液中經(jīng)SYTO9/PI雙染的CGMCC 1.1190細胞進行掃描，會將不同的熒光信號轉換成相應的數(shù)據(jù)信號，經(jīng)計算處理形成雙參數(shù)的二維細胞流式散點圖。因此，將SYTO9/PI雙染法和流式細胞儀結合可用來判定菌體的活性狀態(tài)，得到細菌中活死細胞的比例，并指示細胞膜通透性的變化。

參照Wang Guangyu等[20]的方法測定CGMCC 1.1190菌體細胞膜通透性，并進行適當修改。具體方法如下：將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分數(shù)1%分別接種于盛有10 mL新鮮滅菌TSB的試管中（20 mm×200 mm），37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h至穩(wěn)定期，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于pH 2.0的TSB培養(yǎng)基中酸處理10 min，分別取1 mL的CGMCC 1.1190菌懸液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，用蒸餾水洗滌1 次，重懸于1 mL蒸餾水中，將500 μL的SYTO9與500 μL PI 染液混勻后加到上述4 種菌懸液中進行染色。取1 mL未經(jīng)pH 2.0酸處理的原始對照菌株的CGMCC 1.1190菌懸液，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于1 mL的體積分數(shù)75%乙醇反復振蕩處理1 h，離心（4 ℃、 5 000 r/min，10 min），棄去上清液，用蒸餾水洗滌1 次，重懸于1 mL蒸餾水，加入1 mL PI染液進行染色。

將上述經(jīng)熒光染料染色的5 種菌懸液，在室溫暗處孵育30 min，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），棄去上清液，重懸于2 mL蒸餾水，調整菌懸液的濃度為106～107CFU/mL，由400 目尼龍篩網(wǎng)過濾后，置于 流式細胞儀的進樣針處，吸取單細胞進入流動室進行檢測分析。流式細胞儀的激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長610 nm，以細胞流速為300粒子/s，計數(shù)10 000 個細胞。以未經(jīng)過染色的原始對照CGMCC 1.1190菌體細胞作為陰性對照組；以體積分數(shù)75%乙醇溶液對原始對照組CGMCC 1.1190菌體細胞處理1 h后，再經(jīng)PI染色作為陽性對照組。

1.3.6 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190細胞膜磷脂相變溫度的測定

細菌細胞膜磷脂相變溫度Tc的測定原理參見文獻[21]。采用差示掃描量熱儀測定細菌細胞膜磷脂的相變溫度Tc，Tc指組成磷脂的酰基鏈由固態(tài)晶體向液體無定型態(tài)轉變時的臨界溫度，當外界溫度超過Tc時，?；溁顒有栽鰪姡毎ち鲃有栽龃?。

CGMCC 1.1190菌體細胞膜磷脂相變溫度的測定參照Casadei等[22]的方法，并作適當修改。具體方法如下：分別配制無菌緩沖液A和無菌緩沖液B（10 mmol/L MgCl2與pH 7.5 250 mmol/L Tris）。將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分數(shù)1%分別接種于TSB培養(yǎng)基中，37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期，分別各取1 000 mL的4 株菌株培養(yǎng)液，離心（4 ℃、3 000 r/min，15 min）、棄去上清液，用緩沖液B洗滌1 次，重懸于14 mL的緩沖液B中，加入20 mL氯仿和40 mL甲醇；37 ℃搖床振蕩30 min；再加入20 mL氯仿和20 mL緩沖液B，37 ℃搖床振蕩2 h。室溫靜置20 min，收集下層氯仿層，自然揮發(fā)12 h后，取10 mg樣品置于DSC-8000差示掃描量熱儀中，在-20 ℃條件下預冷35 min，以10 ℃/min梯度的程序升溫，測定CGMCC 1.1190在-10～60 ℃溫度范圍內(nèi)的細胞膜磷脂相變溫度。

1.3.7 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190菌體膜蛋白的測定

CGMCC 1.1190菌體膜蛋白的提取：CGMCC 1.1190菌體膜蛋白的提取參照夏金蘭等[23]的方法，作適當修改。方法如下：配制無菌緩沖液C（pH 7.4 50 mmol/L Tris-HCl），將1.3.1節(jié)活化的CGMCC 1.1190原始對照菌株與1.3.2節(jié)獲得的3 株抗酸性菌株按體積分數(shù)1%接種量接種于裝有10 mL新鮮滅菌的TSB試管（20 mm×200 mm）中，37 ℃、140 r/min搖床振蕩培養(yǎng)18 h，離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min）、收集菌體，用緩沖液C洗滌2 次，重懸于緩沖液C中；用超聲波處理5 min（超聲功率為300 W，15 s/次，間隔10 s），離心（4 ℃、5 000 r/min，10 min），取上清液再次離心（4 ℃、15 000 r/min，20 min）；加入8% TritionΧ-114浸沒沉淀，溶解30 min，離心（4 ℃、15 000 r/min，20 min），加入100 μL去離子水浸沒沉淀，溶解10 min，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）分析CGMCC 1.1190菌體膜蛋白：采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定上述CGMCC 1.1190原始對照菌株與3 株抗酸菌株膜蛋白質量濃度，加入緩沖液A，將此4 株菌株膜蛋白溶液稀釋至5 μg/μL，將各菌株膜蛋白溶液與蛋白上樣緩沖液按照1∶1混勻，共100 μL，沸水浴10 min，各取10 μL分別加入電泳凝膠板的加樣孔中。使用5%濃縮膠和12%分離膠。濃縮膠的部分電壓設置80 V，電泳30 min，分離膠的部分電壓設置120 V，電泳90 min。采用考馬斯亮藍R250對凝膠染色2 h后，加入脫色液，脫色8 h，至各個電泳譜帶清晰可見后，采用凝膠成像系統(tǒng)對其進行掃描成像，并采用Image Lab 4.0.1軟件對所得SDS-PAGE圖譜進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)通過SPSS 22.0軟件處理，采用Duncan多重比較進行顯著性差異分析，P＜0.05表示差異顯著。實驗結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 酸脅迫處理對鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190 D值的影響

CGMCC 1.1190在檸檬酸調節(jié)pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中脅迫處理12 次后，D值的變化見表1。所有處理組D值的擬合度均較高（R2＞0.94）；CGMCC 1.1190在經(jīng)檸檬酸調節(jié)pH值至3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基反復酸脅迫后，隨處理次數(shù)的增加，D值增大，表明其對酸的抗性增加。在pH 2.5脅迫條件下，CGMCC 1.1190第1次酸處理后的D值為（5.15±0.31）min， 第12次熱處理后，D值增加到（196.08±0.45）min （P＜0.05），是第1次酸脅迫處理后的38.1 倍；在pH 2.7脅迫條件下，第12次酸脅迫后D值是第1次酸脅迫時D值的11.5 倍；在pH 3.0脅迫條件下，第12次酸脅迫后D值是第1次熱脅迫處理后的3.3 倍。在pH 2.5脅迫條件下，CGMCC 1.1190經(jīng)反復脅迫作用后抗酸性增加得最快。研究結果說明，CGMCC 1.1190經(jīng)酸脅迫后抗酸性增加，經(jīng)pH值為3.0、2.7、2.5反復酸脅迫處理12 次并轉接培養(yǎng)，D值隨酸脅迫次數(shù)的增加不斷增大，且脅迫pH值越低，D值越大，抗酸性越強。

表1 CGMCC 1.1190經(jīng)不同pH值的酸脅迫處理后D值的變化Table 1 Changes in D values of Salmonella typhimurium CGMCC 1.1190 under acid stress with different pHs

環(huán)境脅迫是指外界環(huán)境條件接近或超過生物體忍耐極限的脅迫作用[24]。酸對微生物的脅迫作用一直是微生物學研究的熱點，而微生物的抗酸性受種類、生長時期和環(huán)境因素的影響[25-26]。Cebrián等[27]通過對金黃色葡萄球菌進行5、30、120 min的亞致死濃度的酸處理后，再置于強酸下，發(fā)現(xiàn)其對酸的抗性增強，這與本研究的結論一致。

2.2 酸脅迫處理對鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190菌落形態(tài)的影響

CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中脅迫處理12 次后，其菌落形態(tài)的變化如圖1所示。在相同的稀釋倍數(shù)下，未經(jīng)酸脅迫處理的對照菌株CGMCC 1.1190培養(yǎng)48 h后，在TSA培養(yǎng)基上菌落較大、平坦、邊緣整齊、質地均勻、呈乳白色，菌落正反面、邊緣與中央部位的顏色一致（圖1A）；經(jīng)過pH 3.0檸檬酸脅迫后，菌落形態(tài)與對照菌株差異明顯，部分菌落的直徑變小、，菌落隆起、表面濕潤、光滑、有光澤、菌落邊緣透明（圖1B）；經(jīng)pH 2.7、pH 2.5酸脅迫后，對照菌株相比，多數(shù)菌落直徑變得更小，菌落邊緣透明、與中央部位的顏色不一致（圖1C、D）。

圖1 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190經(jīng)酸脅迫前后的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of original strain and acid-resistant strains

2.3 酸脅迫處理對鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190個體形態(tài)的影響

CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基脅迫處理12 次后，其在光學顯微鏡下個體形態(tài)的變化見圖2。未經(jīng)酸脅迫處理的對照菌株CGMCC 1.1190在顯微鏡下呈短桿狀或球狀（圖2A）；經(jīng)pH 3.0酸脅迫后的部分個體的形態(tài)明顯變長（圖2B）；而經(jīng)pH 2.7和pH 2.5酸脅迫后，大部分個體變?yōu)楦黠@的長桿狀，且酸脅迫的pH值越低，個體形態(tài)變化越明顯（圖2C、D）。

圖2 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190在光學顯微鏡下的個體形態(tài)（×1 000）Fig.2 Cellular morphology of S.typhimurium CGMCC 1.1190 under optical microscope (× 1 000)

CGMCC 1.1190在pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中酸脅迫12 次后，其在掃描電子顯微鏡下個體形態(tài)的變化見圖3。與對照菌株CGMCC 1.1190相比，經(jīng)酸脅迫并轉接培養(yǎng)的菌株在掃描電子顯微鏡下個體形態(tài)變化明顯，對照菌株的個體形態(tài)呈典型的單短桿狀，外形飽滿，表面光滑，長度比較均勻一致（圖3A）；經(jīng)pH 3.0酸脅迫后，菌株長度差異變化明顯，部分菌株變?yōu)殚L桿狀（圖3B）；經(jīng)pH 2.7酸脅迫后的菌株個體變得更細長， 且在其表面產(chǎn)生了較多的黏液狀、膠質狀的物質，菌株聚集度增加（圖3C）；經(jīng)pH 2.5酸脅迫處理后細長的桿狀菌株，其表面粗糙，覆蓋膠質狀物質，多數(shù)菌聯(lián)結在一起（圖3D）。

圖3 鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190在掃描電子顯微鏡下的個體形態(tài) （×10 000）Fig.3 Cellular morphology of S.typhimurium CGMCC 1.1190 under scanning electron microscope (× 10 000)

上述研究結果表明，CGMCC 1.1190酸脅迫株的菌落形態(tài)和個體形態(tài)與原始對照菌株相比差異顯著，這種形態(tài)的變化可能是其在酸脅迫環(huán)境下生存的一種自我保護方式。高璐等[28]以副溶血性弧菌為研究對象，對其在低鹽度、低pH值和高溫等條件下進行適應性傳代培養(yǎng)，通過掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)的變化，研究發(fā)現(xiàn)，低滲透壓可誘導其由短桿狀變成光滑的球體，低pH值影響了其表面的粗糙度。李忠新等[29]采用K-B法對細菌進行藥物敏感性實驗，篩選出耐β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的菌株，抗藥菌株與標準菌株相比其個體形態(tài)變長。與對照菌株相比，本研究發(fā)現(xiàn)3 株抗酸性CGMCC 1.1190菌株的個體形態(tài)變長，菌落變??；隨著脅迫pH值的降低，抗酸性菌株表面粗糙度增加，表面覆蓋膠質狀物質，表明酸脅迫環(huán)境對CGMCC 1.1190的個體形態(tài)產(chǎn)生較大影響，伴隨菌體形態(tài)的變化，同時生成一些保護性的分泌物，這有助于其在不適的酸性環(huán)境下增強生存能力。

2.4 酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190菌體細胞膜通透性的影響

CGMCC 1.1190在經(jīng)pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中反復脅迫的3 株抗酸性菌株重懸在pH值為2.0的TSB培養(yǎng)基中酸處理，經(jīng)流式細胞儀分析的細胞流式散點圖如圖4所示。由圖4C～F中的Q3區(qū)可知，該區(qū)的細菌細胞數(shù)占比均為0，表明在pH 2.0的強酸處理下對照菌株和3 株抗酸性菌株中所有細胞細胞膜的通透性都發(fā)生變化。對照菌株和3 株抗酸性菌株置于pH值為2.0的強酸環(huán)境中處理10 min后，通過散點圖的4C～F的Q2區(qū)可知，在此區(qū)域內(nèi)細菌細胞膜的通透性雖然發(fā)生一定程度的改變，經(jīng)過適應期后仍能恢復活性而存活下來，存活細胞數(shù)的所占比例分別是62.6%、75.5%、87.4%和97.0%，說明隨著酸脅迫pH值的降低，能夠恢復活性的細菌細胞數(shù)在明顯增加。由圖4C～F中的Q1區(qū)可知，將對照菌株和酸脅迫的3 株抗酸性菌株置于pH值為2.0的強酸環(huán)境中處理10 min后，對照菌株的死菌比例為33.8%；3 株抗酸性菌株死菌比例分別為23.2%、9.9%和2.9%，均明顯低于對照菌株的死菌比例，且隨酸脅迫pH值降低，死菌比例明顯降低，表明其抗酸性增強，抗H+的通透性增大。因PI只能穿過不完整的細胞壁和細胞膜，即PI染色區(qū)域的死菌比例越高，細菌細胞膜通透性越大。

圖4 CGMCC 1.1190原始對照菌株及其分別經(jīng)不同pH值酸脅迫處理并轉接培養(yǎng)12 次的抗酸性菌株的SYTO9/PI染色細胞流式散點圖Fig.4 Flow cytometric dot plots of unstained and SYTO9/PI stained cells of CGMCC 1.1190 and acid-resistant strains

在相同強酸致死環(huán)境下，經(jīng)過酸脅迫的3 株抗酸性菌株細胞膜的通透性顯著低于對照野生菌株細胞膜的通透性。因此推測，與對照野生菌株相比，經(jīng)過酸脅迫的3 株抗酸性菌株通過降低細胞膜通透性的方式限制了大量H+進入菌體內(nèi)，減少了H+在菌體內(nèi)積累對細胞的毒害作用，從而降低了菌株細胞死亡比例。如圖4所示，隨著酸脅迫pH值降低，CGMCC 1.1190抗酸性菌株細胞偏離Q1區(qū)，死菌比例降低，進入Q2區(qū)的抗酸性菌株細胞比例增加。本研究通過酸脅迫方式獲得的3 株抗酸性的菌株可能通過降低其細胞膜對H+、PI等的通透性，適應強酸致死環(huán)境條件；通過提高其對更強的酸環(huán)境的耐受度，維持細胞正常的生理功能。

微生物在遭受不適應生長的外界環(huán)境條件時，其細胞生理代謝活動會發(fā)生改變。流式細胞技術是從細胞水平對將熒光染色的細胞個體進行快速、多參數(shù)細胞定量分析技術，針對生物個體的細胞膜通透性、生理代謝活動、凋亡周期等細胞特性，分選特定狀態(tài)的細胞群體[30]。 微生物在面臨不適生長的外界環(huán)境時其細胞膜通透性會發(fā)生改變，Nonv等[31]研究了抗生素處理的金黃色葡萄球菌和黃褐球菌細胞膜的通透性，發(fā)現(xiàn)細胞膜通透性的增大是藥物處理細菌致死的機理之一。微生物細胞膜通透性的降低是細菌在脅迫條件下激活的一種生理保護性變化[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，在一定的pH值范圍內(nèi)，CGMCC 1.1190抗酸性菌株的酸脅迫pH值越低，抗酸性越強，細胞膜通透性越低；酸脅迫后產(chǎn)生抗酸性菌株可能是通過降低細胞膜對H+的通透性，減少H+進入細胞質，達到保護菌體的作用。

2.5 酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌 CGMCC 1.1190細胞膜磷脂相變溫度的影響

差示掃描量熱法可用于對微生物細胞膜磷脂相變的研究，測定其細胞膜磷脂的物理狀態(tài)變化時吸收或放出的熱量。CGMCC 1.1190在經(jīng)pH值為3.0、2.7和2.5的TSB培養(yǎng)基中反復酸脅迫12 次并轉接培養(yǎng)，獲得3 株抗酸性菌株的細胞膜脂類提取物的差示掃描量熱圖譜見圖5。圖5A～D中皆出現(xiàn)了一個峰，此峰值表示CGMCC 1.1190細胞膜磷脂的相變溫度（Tc），即磷脂的熔點（Tm）；未經(jīng)酸脅迫處理的對照菌株CGMCC 1.1190菌株的Tm為18.99 ℃，隨著CGMCC 1.1190抗酸性菌株的酸脅迫pH值從3.0降低至2.5，其磷脂的Tm從26.69 ℃增加到31.72 ℃，酸脅迫pH值越低，其磷脂的Tm越高。一定范圍內(nèi)，細胞膜磷脂的Tm越高，其流動性越弱。與對照菌株相比，CGMCC 1.1190抗酸性菌株的細胞膜流動性降低，這種適應酸性環(huán)境的應激反應，阻礙環(huán)境中過多的H+進入菌體內(nèi)，保證了細胞內(nèi)部正常的酸堿平衡，有利于其在酸脅迫環(huán)境中生存。

圖5 CGMCC 1.1190菌株細胞膜脂類提取物的差示掃描量熱圖譜Fig.5 Differential scanning calorimetry graphs for membrane lipids extracted from whole cells of CGMCC 1.1190 and acid-resistant strains

微生物為適應外界生長環(huán)境條件的變化其細胞膜脂質會發(fā)生變化，磷脂的變化會影響細胞膜的結構和功能，對其細胞膜流動性的影響中起非常重要作用[33]。有研究表明，微生物細胞膜流動性的降低有利于誘導其對熱、鹽或消毒劑等不適生存環(huán)境條件的抗性[34-35]。álvarez-Ordó?ez等[36]研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可誘導微生物膜脂質組成的變化，通過改變其細胞膜磷脂中不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸的比例來保證細胞膜正常的流動性，維持正常的生理功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與野生菌株相比，3 株抗酸性CGMCC 1.1190菌株的磷脂相變溫度Tc皆升高，細胞膜流動性降低；脅迫pH值越低，Tc也越高，膜流動性越低，有利于菌株在強酸環(huán)境下調整細胞膜的流動狀態(tài)而保持其正常生理功能。微生物膜脂質雙分子層除了起到保護性屏障作用外，也是其與外界物質、信息交流的過程中不可缺少的。因此，細胞膜在細菌的脅迫誘導抗性方面起到重要的作用，通過控制其流動性來協(xié)調各種生命活動的正常進行，從而增強其生存能力。

2.6 酸脅迫對鼠傷寒沙門氏菌CGMCC 1.1190膜蛋白 表達的影響

膜蛋白是革蘭氏陰性菌細胞膜結構的重要組成成分，以β桶狀結構鑲嵌于細胞膜，對維持細胞內(nèi)部結構的穩(wěn)定、各種物質信息的交流以及致病性方面均起到非常重要的作用。本研究所分離的CGMCC 1.1190對照菌株及3 株抗酸性菌株的膜蛋白，經(jīng)過SDS-PAGE分析得到圖6。這4 株CGMCC 1.1190菌株膜蛋白的分子質量主要分布在25～180 kDa，但3 株抗酸性菌株與對照菌株在組成及其分子質量分布上存在著較大差異。與對照菌株相比，隨著酸脅迫pH值的降低，對于3 株抗酸性菌株的膜蛋白，分子質量在35～180 kDa的部分條帶顏色逐漸變深，說明此分子質量范圍的膜蛋白表達量明顯提高；與對照菌株相比，抗酸性菌株在135 kDa 和180 kDa處增加了特異條帶，說明CGMCC 1.1190在酸脅迫下產(chǎn)生了某些抗酸性蛋白，這些蛋白可能是酸脅迫下與應激反應有關的酸激蛋白。上述研究結果表明，pH 3.0、pH 2.7、pH 2.5酸脅迫可誘導CGMCC 1.1190一些膜蛋白表達量的增加或產(chǎn)生酸應激蛋白。由此推測，這些相關蛋白表達可及時修復不適應酸環(huán)境對其造成的分子損傷，導致酸脅迫菌株的DNA復制、轉錄和蛋白質合成得以正常進行，最終使CGMCC 1.1190抗酸性菌株能夠在強酸環(huán)境中生存下來。

圖6 CGMCC 1.1190原對照菌株及其分別經(jīng)不同pH值酸脅迫并轉接培養(yǎng)的3 株菌株膜蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of outer membrane proteins in CGMCC 1.1190 and acid-resistant strains

酸性環(huán)境可以激活細菌的雙組分調控系統(tǒng)，產(chǎn)生一系列有利于細胞活性并參與調控的酸激蛋白，從而保護菌體并修復其損傷，維持細菌在脅迫條件下的存活。Shenoy等[37]對小腸結腸炎耶爾森氏菌在45 ℃下處理1 h后，該菌合成了特殊的膜蛋白，從而增強了對高溫的抵抗 能力。本研究發(fā)現(xiàn)，3 株抗酸性CGMCC 1.1190菌株一些膜蛋白表達量和組成也發(fā)生了變化，可能是酸脅迫下CGMCC 1.1190合成了與抗酸性相關的蛋白質；這些膜蛋白是通過改變哪些代謝路徑來提高微生物對強酸環(huán)境產(chǎn)生的抗性，相關工作正在進行。

3 結 論

CGMCC 1.1190經(jīng)pH 3.0、pH 2.7、pH 2.5反復酸脅迫處理12 次并轉接培養(yǎng)后產(chǎn)生了抗酸性，與對照菌株相比，抗酸性菌株的個體形態(tài)、細胞膜通透性、流動性和膜蛋白表達均發(fā)生了變化。在一定的pH值范圍內(nèi)，隨著酸脅迫pH值的降低，抗酸性菌株的個體形態(tài)變長，細胞膜的H+通透性降低，Tm升高，流動性降低，分子質量在35～180 kDa的部分膜蛋白表達量提高、表達種類增加，菌株抗酸性增強。綜上所述，CGMCC 1.1190在遭遇酸脅迫環(huán)境時會產(chǎn)生抗酸性，并通過改變自身個體形態(tài)、調整細胞膜通透性、流動性及膜蛋白表達量來適應酸脅迫環(huán)境，增強生存能力。