朱巧梅，于曉雯，陳海濤，殷麗君,*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.北京工商大學(xué) 北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

姜黃素又稱(chēng)二阿魏?；淄椋菑慕平S屬植物姜黃、郁金、莪術(shù)等的根莖中提取的一種天然多酚化合物。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及多種臨床研究表明姜黃素具有多種生理活性，如抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化以及抗癌活性[1]。 姜黃素的藥理安全性以及生物活性使其在治療多種疾病方面具有巨大的應(yīng)用潛力。然而，姜黃素的水溶性差（11 ng/mL）、生物利用率低、化學(xué)穩(wěn)定性差，在紫外線及加熱條件下易分解[2]，這些局限性極大阻礙其在食品中的加工應(yīng)用。為了克服這些應(yīng)用障礙，研究者采取了多種研究方法，如構(gòu)建納米顆粒、脂質(zhì)體、膠束以及微納米乳液等[3]。其中，乳液遞送體系是目前最常用的一種方法。

乳液是指一種液體以液滴的形式分散于與其互不相溶的另外一種液體中，主要包括水包油（O/W）與油包水（W/O）兩種類(lèi)型。乳液是一種熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，在加工貯存過(guò)程中易產(chǎn)生相分離、絮凝、聚結(jié)等失穩(wěn)現(xiàn)象[4-5]。目前，在實(shí)際的乳液基食品加工中通常采用的是合成類(lèi)乳化劑，如蔗糖脂肪酸酯、Tween、甘油單硬脂酸酯等。然而，2015年發(fā)表在Nature上的一篇文章報(bào)道，合成類(lèi)乳化劑Tween-80會(huì)潛在增加結(jié)腸炎、代謝綜合征以及其他慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[6]?；谀壳昂铣深?lèi)乳化劑仍存在著乳化穩(wěn)定性、安全性欠佳等問(wèn)題，尋求天然高分子乳化劑代替合成類(lèi)乳化劑將是食品產(chǎn)業(yè)的一個(gè)重要趨勢(shì)。蛋白質(zhì)是常用的一種天然乳化劑，然而蛋白類(lèi)乳化劑制備的乳液對(duì)溫度、pH值、鹽離子等敏感，環(huán)境因子的改變會(huì)導(dǎo)致乳液的失穩(wěn)。近年來(lái)，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)（酶促交聯(lián)、Maillard反應(yīng)等）、靜電復(fù)合等方式將乳化穩(wěn)定性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)與多糖結(jié)合構(gòu)建新型乳化劑成為國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[7-9]。

玉米纖維膠（corn fiber gum，CFG）是從玉米加工副產(chǎn)物麩皮中提取出的阿拉伯木聚糖（半纖維素B）。在CFG提取過(guò)程中，不可避免地會(huì)含有少量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等成分。蛋白質(zhì)可增強(qiáng)多糖在油-水界面的吸附，有利于降低界面張力，強(qiáng)化界面膜黏彈性。多糖分子鏈 伸向水相中產(chǎn)生靜電排斥和位阻作用，從而有效阻止油滴的聚集和絮凝，從而使得多糖具有良好的乳化性及穩(wěn)定性[10]。大量研究報(bào)道了CFG的乳化活性，Yadav等的研究表明CFG的乳化活性接近阿拉伯膠，有望成為阿拉伯膠的替代物[11-13]；Bai Long等重點(diǎn)比較了阿拉伯膠、甜菜果膠以及CFG 3 種植物源多糖制備乳液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，阿拉伯膠、甜菜果膠乳化穩(wěn)定性，特別是界面穩(wěn)定性要優(yōu)于CFG。相比之下，CFG穩(wěn)定的乳液更易發(fā)生絮凝、聚結(jié)等失穩(wěn)現(xiàn)象[14]。為了改善CFG的乳化穩(wěn)定性，Liu Yan等采用辣根過(guò)氧化物酶構(gòu)建CFG-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的共價(jià)復(fù)合物，結(jié)果表明，CFG-BSA共價(jià)復(fù)合物能夠強(qiáng)化界面膜強(qiáng)度，有效改善了乳液的理化及凍融穩(wěn)定性[15]。

乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）具有優(yōu)異的乳化性和凝膠性[16]。此外，WPI的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、消化吸收率高，是食品工業(yè)中一種重要的功能性食品配料。本實(shí)驗(yàn)擬采用Maillard共價(jià)交聯(lián)方式對(duì)CFG、WPI進(jìn)行改性，將改性后的共聚物作為新型乳化劑構(gòu)建包埋姜黃素的乳液體系，以期提高姜黃素的溶解度、生物利用率。此外，有助于改善單一CFG、乳清分離蛋白的理化穩(wěn)定性，從而進(jìn)一步拓寬CFG在食品行業(yè)中的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)玉米麩皮副產(chǎn)物的高值化加工利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米麩皮 中糧生化能源有限公司；WPI （純度≥95%） 美國(guó)戴維斯柯食品國(guó)際公司；姜黃素（純度≥95%） 河北澤華生物科技有限公司；中鏈甘油三酯（純度≥99%） 瑞士龍沙集團(tuán)；高溫淀粉酶 北京阿拉丁試劑公司；BCA蛋白定量試劑盒 上海炎熙生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速剪切機(jī) 德國(guó)IKA公司；NS11001L高壓均質(zhì)機(jī) 意大利Niro Saoavi公司；Microtrac S3500激光粒度分析儀 美國(guó)麥奇克儀器有限公司；LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀 德國(guó)LUM儀器公司；傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國(guó)珀金埃爾默公司；AR2000流變儀 美國(guó)TA公司；GL高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；LGJ冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 CFG的制備

參考Deng Changning等的方法[17]，將玉米麩皮研磨成粉，過(guò)40 目篩，用7 倍質(zhì)量的正己烷浸泡玉米麩皮粉末，磁力攪攔2 h后除去上清液。將沉淀物置于50 ℃烘箱中熱風(fēng)干燥8 h。用10 倍體積的蒸餾水浸泡脫脂玉米麩皮粉末，在100 ℃下煮沸30 min使存在于麩皮粉末中的淀粉完全糊化。待溫度降至80 ℃后，加入高溫淀粉酶反應(yīng)30 min，用碘液驗(yàn)證麩皮中的淀粉是否完全去除。然后過(guò)濾除去上清液，用蒸餾水反復(fù)沖洗3～4 次，然后將沉淀物置于50 ℃烘箱中干燥，得到除油除淀粉的玉米麩皮粉。按照稱(chēng)取除油除淀粉的玉米麩皮粉與0.625 mol/L氫氧化鈉溶液按1∶10（m/V）攪攔均勻后避光放置25℃恒溫振蕩器上100 r/min振蕩4 h，再4000 r/min離心20 min取上清液。用濃鹽酸調(diào)上清液pH值至4.2后，5000 r/min離心30 min取上清液。于上清液中邊攪攔邊緩慢加入2 倍體積的無(wú)水乙醇，靜置待CFG析出及沉淀。30 min后除去上清液，收集白色絮狀沉淀物進(jìn)行凍干，凍干24 h后得到CFG，研磨待用。

1.3.2 CFG-WPI Maillard共聚物的制備

應(yīng)用干熱法制備CFG-WPI Maillard共聚物。將2 g WPI、6 g CFG溶于100 mL去離子水中，磁力攪攔4 h使樣品充分溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至7.0。之后將樣品放置于-80 ℃冰箱24 h后進(jìn)行凍干，收集凍干粉末，放置于預(yù)熱到60 ℃的干燥器中并利用飽和溴化鉀溶液控制體系內(nèi)相對(duì)濕度為79%。每隔一段時(shí)間（0～120 h）取樣并將樣品命名為M-0、M-12、M-24、M-36、M-48、M-72、M-96、M-120（數(shù)字表示放置的時(shí)間/h），將樣品放于 -20 ℃冰箱中保存，待后續(xù)對(duì)共聚物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

1.3.3 姜黃素乳液的制備

以含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%姜黃素的甘油三酯作為油相，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的乳化劑（CFG、WPI、CFG-WPI混合物（質(zhì)量比3∶1）以及CFG-WPI Maillard共聚物）的水溶液為水相；將油相與水相以1∶9的質(zhì)量比混合，首先經(jīng)過(guò)高速剪切機(jī)的初步均質(zhì)，以11 000 r/min的剪切速率剪切2 min；然后采用60 MPa高壓均質(zhì)機(jī)將粗乳液進(jìn)行均質(zhì)。最終獲得姜黃素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、油相質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、乳化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.8%的姜黃素乳液。

1.3.4 CFG、WPI、CFG-WPI Maillard共聚物的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

稱(chēng)取適量樣品溶于去離子水中，利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)量濃度后，加入去離子水對(duì)樣品進(jìn)行稀釋使得各個(gè)樣品最終蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均為1 mg/mL， 按照體積比3∶1的比例將樣品溶液與上樣緩沖液（體積分?jǐn)?shù)25%甘油、60 mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）、2 g/100 mL十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、14.4 mmol/L 2-巰基乙醇、體積分?jǐn)?shù)0.1%溴酚藍(lán)和50 mmol/L乙二胺四乙酸）混合后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE）。電泳所采用的分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%，上樣量為20 μL。用考馬斯亮藍(lán)R-250染色15 min，之后脫色3～4 次，拍照獲得蛋白條帶。

1.3.4.2 FTIR分析

將光譜級(jí)溴化鉀放于105 ℃烘箱中烘干4 h，使其脫去結(jié)晶水。稱(chēng)取20 mg樣品及200 mg溴化鉀粉末放于瑪瑙研缽中，在日光燈照射下研磨使其完全混合均勻后壓制成片，放于FTIR儀中進(jìn)行檢測(cè)分析。具體參數(shù)設(shè)置為：分辨率4 cm-1，掃描32 次，測(cè)定波數(shù)400～4 000 cm-1。

1.3.5 姜黃素乳液性質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 粒徑測(cè)定

采用Microtrac S3500激光粒度分析儀測(cè)定單一WPI、CFG及不同反應(yīng)時(shí)間下形成的CFG-WPI共聚物（M-0、M-12、M-24、M-36、M-48、M-72、M-96、M-120）制備的姜黃素乳液粒徑，取少量乳液樣品加入樣品池中，通過(guò)攪攔使乳液均勻分散，通過(guò)儀器直接讀取乳液的平均粒徑（D4,3），并以此作為乳液粒徑。設(shè)定樣品折射率為1.42，分散介質(zhì)折射率為1.33。

離子強(qiáng)度的影響：配制不同濃度（120～240 mmol/L） 的CaCl2溶液，以1∶1的體積比將乳液與不同濃度的CaCl2溶液混合，靜置24 h后測(cè)定乳液的粒徑。

pH值的影響：分別采用0.1 mol/L NaOH以及HCl溶液將乳液的pH值調(diào)至3～7，放置于-4 ℃冰箱中貯存24 h后，采用Microtrac S3500激光粒度分析儀測(cè)定乳液的粒徑。

1.3.5.2 穩(wěn)定性分析

采用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀分析不同條件下制備的姜黃素乳液的穩(wěn)定性。取400 μL姜黃素乳液移入直徑2 mm的樣品皿底部，設(shè)定溫度為25 ℃，離心速率為4 000 r/min，每30 s掃描一次，共掃描255 次，光因子設(shè)為1.00，通過(guò)儀器自帶軟件分析得到的LUMiSizer穩(wěn)定性圖獲得樣品的透光量百分比，即澄清指數(shù)，進(jìn)而分析乳液的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

1.3.5.3 黏度測(cè)定

參考Zhu Qiaomei等[18]的方法，使用流變儀對(duì)乳液的黏度進(jìn)行測(cè)定。采用穩(wěn)態(tài)剪切模式，設(shè)定剪切速率為1～100 s-1，選用直徑為40 mm的鋁制平板夾具并設(shè)置其間距為1 mm，通過(guò)Peltier系統(tǒng)控制平板上的溫度恒 定為25 ℃。

1.3.5.4 姜黃素含量的測(cè)定

乳液中姜黃素含量測(cè)定參照Χu Guangrui等[19]的方法，并做適當(dāng)修改。取2 mL新制姜黃素乳液加入2 mL體積比為1∶1的氯仿-乙醇混合溶液，振蕩混合均勻后靜置，移取含有姜黃素的有機(jī)相層于10 mL試管中，重復(fù)萃取一次后合并萃取液，在425 nm波長(zhǎng)處測(cè)定萃取液吸光度，根據(jù)姜黃素-正己烷標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定乳液中未包埋的姜黃素質(zhì)量濃度，并按公式（1）計(jì)算包埋率。

1.3.5.5 體外模擬胃腸消化實(shí)驗(yàn)

體外模擬胃部消化：參考Fan Yuting等[20]的方法，取7.5 mL姜黃素乳液與10 mL模擬胃液（simulated gastric fluid，SGF）（含3.2 mg/mL胃蛋白酶、0.15 mol/L氯化鈉）混合均勻后，將體系pH值調(diào)至2.0，置于37 ℃恒溫振蕩水浴槽中130 r/min下振蕩模擬體外胃部消化1 h。

體外模擬小腸消化：體外模擬胃部消化后，將體系pH值調(diào)至7.5，加入15 mL模擬腸液（simulated intestinal fluid，SIF）（包括2.0 mg/mL 8 U/mg胰脂肪酶、 20 mg/mL膽鹽、10 mmol/L CaCl2）。在37 ℃恒溫振蕩水浴槽中130 r/min振蕩模擬體外小腸消化2 h。在消化過(guò)程中，使用pH-stat自動(dòng)滴定裝置對(duì)反應(yīng)體系的pH值進(jìn)行監(jiān)測(cè)，通過(guò)滴定0.25 mol/L氫氧化鈉溶液維持體系pH值恒定（7.5）。記錄所用氫氧化鈉溶液體積，在時(shí)間t內(nèi)游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）的釋放率通過(guò)公式（2）進(jìn)行計(jì)算。

式中：Vt為t時(shí)間內(nèi)消耗的NaOH體積/mL；c為NaOH溶液的濃度（0.25 mol/L）；Moil為甘油三酯的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；moil為7.5 mL姜黃素乳液中的甘油三酯質(zhì)量/g。

1.3.5.6 姜黃素生物有效性測(cè)定

取體外模擬小腸消化液，11 000 r/min離心50 min后，溶液分為3 層，上層為未被酶解的油相，中間為膠束溶液，底層為沉淀物層。取中間膠束層溶液，使用0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾除去微晶聚合物，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定膠束中姜黃素的含量。色譜條件為：SHISEIDO C18反相色譜柱（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相分別為體積分?jǐn)?shù)2%乙酸（A）、色譜級(jí)乙腈（B）。上樣量為20 μL，梯度洗脫程序：0～15 min，B相由35%線性上升至70%；15～20 min，B相由70%線性下降至35%；20～25 min，B相為35%。流速設(shè)置為1 mL/min。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為425 nm。用公式（3）計(jì)算姜黃素的生物有效性。

式中：c膠束和c初始分別表示姜黃素在膠束以及初始乳液中的濃度/（mol/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS Statistics 20.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，并采用Duncan多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CFG-WPI Maillard共聚物熱反應(yīng)時(shí)間對(duì)姜黃素乳液粒徑及穩(wěn)定性的影響

由圖1A可知，CFG制備的姜黃素乳液粒徑為0.95 μm，而WPI制備的姜黃素乳液粒徑為0.88 μm，經(jīng)過(guò)Maillard反應(yīng)后，由各階段Maillard產(chǎn)物制備姜黃素乳液的粒徑在0.663～0.711 μm范圍內(nèi)。結(jié)果表明，與單一WPI、CFG相比，CFG-WPI Maillard共聚物具有更好的乳化效果。隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，各階段所得到的

圖1 單一WPI、CFG以及不同熱處理時(shí)間下CFG-WPI Maillard 共聚物對(duì)姜黃素乳液粒徑（A）以及澄清指數(shù)（B）的影響Fig.1 Effects of pure WPI, CFG and CFG-WPI conjugates obtained at different thermal treatment times on the particle size (A) and clarification index (B) of emulsions

共聚物對(duì)姜黃素乳液粒徑并沒(méi)有顯著影響。為了進(jìn)一步評(píng)估不同階段的CFG-WPI Maillard共聚物對(duì)乳液長(zhǎng)期穩(wěn)定性的影響，采用LUMiSizer穩(wěn)定性分析儀對(duì)乳液進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1B所示。澄清指數(shù)與乳液的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，澄清指數(shù)越高表明體系越不穩(wěn)定，單一WPI、CFG所制備姜黃素乳液的澄清指數(shù)分別為0.41、0.14，而CFG-WPI Maillard共聚物所制備姜黃素乳液的澄清指數(shù)與單一WPI、CFG所制備姜黃素乳液的澄清指數(shù)顯著下降，且隨著熱反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，澄清指數(shù)進(jìn)一步逐漸下降，說(shuō)明乳液的穩(wěn)定性有所提高。原因可能在于，隨著熱反應(yīng)的不斷進(jìn)行，CFG與WPI的接枝度也在增加，因此改善了乳液的穩(wěn)定性[21]。而由于M-96與M-120制備的姜黃素乳液澄清指數(shù)無(wú)顯著差異，考慮到制備時(shí)間成本等因素，后續(xù)選用M-96作為代表性CFG-WPI Maillard共聚物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 CFG-WPI Maillard共聚物結(jié)構(gòu)解析結(jié)果

2.2.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

采用SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CFG-WPI共聚物的形成，結(jié)果如圖2所示。一般來(lái)說(shuō)，分子質(zhì)量較高的物質(zhì)在SDS-PAGE條帶中遷移速率比較慢，因而在電泳條帶的頂端會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的蛋白信號(hào)。A譜帶的分子質(zhì)量約為67 kDa，為BSA譜帶。在Maillard反應(yīng)的起始階段，未在電泳條帶頂端觀察到明顯的高分子質(zhì)量譜帶，而當(dāng)Maillard反應(yīng)時(shí)間為12 h時(shí)，在濃縮膠與分離膠的邊界處，出現(xiàn)了高分子量蛋白譜帶，證明了Maillard反應(yīng)產(chǎn)物的產(chǎn)生。當(dāng)Maillard反應(yīng)時(shí)間達(dá)到96 h時(shí)，電泳頂端顏色 逐漸變深，而B(niǎo)SA譜帶的顏色逐漸變淺，并未完全消失，說(shuō)明Maillard反應(yīng)仍在不斷持續(xù)進(jìn)行，所生成的高分子質(zhì)量物質(zhì)的量在增加。由圖2B可知，隨著反應(yīng)的進(jìn)行， CFG-WPI Maillard共聚物的褐變程度也在不斷增加，可能是Maillard反應(yīng)是個(gè)不斷連續(xù)的反應(yīng)過(guò)程，一部分共聚物繼續(xù)反應(yīng)并進(jìn)入反應(yīng)末期，從而生成褐色物質(zhì)。

圖2 WPI、CFG以及不同熱反應(yīng)時(shí)間下CFG-WPI Maillard共聚物的SDS-PAGE圖（A）和表觀圖片（B）Fig.2 Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis (A) and visual appearance (B) of WPI, CFG and CFG-WPI Maillard conjugates

2.2.2 FTIR分析結(jié)果

如圖3所示，與CFG、WPI相比，經(jīng)過(guò)96 h的Maillard反應(yīng)后，CFG-WPI Maillard聚合物在1 406、1 543 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，可能是多糖的羰基與蛋白的氨基進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，交聯(lián)后會(huì)引起糖環(huán)內(nèi)O—H鍵的變形振動(dòng)并導(dǎo)致C—N鍵的伸縮振動(dòng)[15]。此外，CFG-WPI Maillard聚合物在1 032 cm-1處出現(xiàn)明顯較CFG更強(qiáng)的吸收峰，而WPI在此處無(wú)吸收峰，其原因可能是多糖鏈上含有多個(gè)羥基，當(dāng)多糖與蛋白發(fā)生共價(jià)交聯(lián)后，增加了蛋白中羥基及碳氧雙鍵的數(shù)量，導(dǎo)致了此峰強(qiáng)度的增加。在562 cm-1處為N—H的彎曲振動(dòng)峰，與單獨(dú)的WPI相比， CFG-WPI Maillard聚合物在562 cm-1處的吸收峰較弱，可能的原因是Maillard反應(yīng)消耗一定量的氨基從而導(dǎo)致其數(shù)量減少。通過(guò)對(duì)比單獨(dú)CFG、WPI與CFG-WPI Maillard共聚物的FTIR光譜，可以進(jìn)一步證明CFG、WPI之間形成了分子間聚合物。

圖3 WPI、CFG以及CFG-WPI Maillard共聚物的FTIR圖Fig.3 Fourier transform infrared spectrum of WPI, CFG and CFG-WPI Maillard conjugates

2.3 不同乳化劑對(duì)姜黃素乳液粒徑和黏度的影響

圖4A為CFG、WPI、CFG-WPI混合物以及Maillard反應(yīng)96 h制備的CFG-WPI共聚物（M-96）所穩(wěn)定乳液的粒徑圖。4 種姜黃素乳液的粒徑集中于0.6～1.0 μm之間。與單一WPI、CFG制備的姜黃素乳液粒徑相比，CFG與WPI混合物以及Maillard共聚物制備的姜黃素乳液粒徑較低，尤其是Maillard共聚物制備的粒徑最低（684 nm），表明CFG-WPI Maillard共聚物制備的姜黃素乳液穩(wěn)定性較高。CFG-WPI Maillard共聚物制備的姜黃素乳液乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)的原因可能在于糖基化可增強(qiáng)蛋白質(zhì)的空間位阻和靜電斥力，從而更有效地抑制了油滴的絮凝的聚結(jié)。如圖4B所示，4 種姜黃素乳液的黏度隨著剪切速率的增大而明顯下降，表現(xiàn)出剪切稀化的流體特征。 與WPI制備的姜黃素乳液相比，CFG制備的姜黃素乳液的 黏度較高，主要與CFG較大的分子質(zhì)量有關(guān)。 CFG-WPI Maillard共聚物制備的姜黃素乳液黏度最大，這在一定程度上能夠阻止姜黃素乳液滴之間的聚結(jié)過(guò)程[22]?？傮w而言，較小的乳滴尺寸和較高的黏度均有助于減緩液滴的沉降，更有效改善姜黃素乳液的穩(wěn)定性。

圖4 WPI、CFG、WPI-CFG混合物以及CFG-WPI Maillard共聚物 制備的姜黃素乳液粒徑（A）及表觀黏度（B）Fig.4 Average particle size (A) and apparent viscosity (B) of emulsions prepared with pure WPI, CFG, CFG-WPI physical mixture and CFG-WPI Maillard conjugates

2.4 pH值、離子強(qiáng)度對(duì)姜黃素乳液粒徑的影響

外界環(huán)境因子如pH值、離子強(qiáng)度是影響姜黃素乳液穩(wěn)定性的重要因素。如圖5A所示，單一WPI穩(wěn)定的姜黃素乳液在遠(yuǎn)離等電點(diǎn)（pI 4.0～5.0）的條件下粒徑無(wú)明顯差異，此時(shí)姜黃素乳液液滴之間的靜電斥力大于相互吸引的范德華力；在等電點(diǎn)附近（pH 4、5），姜黃素乳液的粒徑分別增加到5.33、21.32 μm，這是由于穩(wěn)定蛋白質(zhì)姜黃素乳液的靜電排斥力減弱，姜黃素乳液產(chǎn)生了絮凝、聚結(jié)等失穩(wěn)現(xiàn)象。WPI和CFG混合物穩(wěn)定的姜黃素乳液也存在類(lèi)似的變化趨勢(shì)，因此這在很大程度上限制了WPI在酸性飲料中的應(yīng)用。在pH值為3～7的范圍內(nèi)，CFG-WPI Maillard共聚物穩(wěn)定的姜黃素乳液均具有良好的pH值穩(wěn)定性，姜黃素乳液粒徑基本保持不變。Maillard反應(yīng)可以使蛋白的氨基與多糖的羰基糖基化，蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子的空間位阻增加[23]，使得蛋白構(gòu)象更加穩(wěn)定，從而克服蛋白質(zhì)分子在等電點(diǎn)附近的絮凝聚沉。

由圖5B可知，Ca2+濃度對(duì)不同乳化劑制備的姜黃素乳液的粒徑產(chǎn)生顯著的影響，當(dāng)Ca2+濃度從0升高至120 mmol/L時(shí)，WPI以及CFG-WPI混合物所穩(wěn)定的 姜黃素乳液的粒徑分別由0.89、0.82 μm增大至4.40、2.78 μm。這些現(xiàn)象可以歸因?yàn)镃a2+對(duì)液滴之間靜電排斥的屏蔽效應(yīng)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的凈電荷下降，從而增加了姜黃素乳液發(fā)生絮凝、聚結(jié)的傾向[24]。而CFG以及CFGWPI Maillard共聚物穩(wěn)定的姜黃素乳液在不同CaCl2濃度條件下粒徑均保持不變。CFG能夠提供空間位阻保護(hù)作用[25-27]， 使得CFG-WPI Maillard共聚物在姜黃素乳液表面形成更強(qiáng)的空間排斥效應(yīng)，減少外界離子對(duì)姜黃素乳液的影響。

圖5 不同pH值（A）、CaCl2濃度（B）對(duì)WPI、CFG、WPI-CFG 混合物以及CFG-WPI共聚物穩(wěn)定姜黃素乳液粒徑的影響Fig.5 Effects of pH (A) and CaCl2 concentration (B) on the average particle size of emulsions stabilized by WPI, CFG, WPI-CFG physical mixture and WPI-CFG conjugates

2.5 不同乳化劑對(duì)姜黃素乳液中姜黃素包埋率的影響

姜黃素是近年來(lái)備受關(guān)注的生物活性物質(zhì)，然而其水溶解性較差，僅為11 ng/mL。由圖6A可知，4 種姜黃素乳液中的姜黃素包埋率為92%～98%，折合為水中的溶解度相當(dāng)于460～490 ng/mL，因此納米姜黃素乳液是一種良好的姜黃素遞送體系。與CFG、WPI以及CFG和WPI的混合物相比，CFG-WPI Maillard共聚物穩(wěn)定姜黃素乳液的姜黃素包埋率較高。從圖6B可以看出， WPI-CFG Maillard共聚物制備出的姜黃素乳液顏色較淺，更加均勻，對(duì)姜黃素的包埋能力更強(qiáng)。

圖6 WPI、CFG、WPI-CFG混合物以及CFG-WPI共聚物穩(wěn)定 姜黃素乳液及其姜黃素包埋率Fig.6 Encapsulation efficiency of curcumin in emulsions stabilized by WPI, CFG, CFG-WPI physical mixture and CFG-WPI conjugates

2.6 不同乳化劑及粒徑對(duì)姜黃素乳液脂肪水解速率的影響

采用pH-stat法測(cè)定了不同姜黃素乳液脂肪水解速率的變化情況。如圖7A所示，對(duì)于4 種姜黃素乳液，在小腸消化的前60 min內(nèi)FFA釋放量快速增加，隨后緩慢增加，結(jié)果表明脂肪酶分子快速吸附在姜黃素乳液表面，將甘油三酯轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸。在消化的中后期，WPI穩(wěn)定的姜黃素乳液水解速率較CFG、CFG與WPI共混物以及CFG-WPI Maillard共聚物穩(wěn)定的3 種姜黃素乳液的脂質(zhì)水解速率更快，說(shuō)明CFG的存在能夠降低脂質(zhì)水解速率。Χu Duoxia等報(bào)道在水相中共聚物的黏度較高時(shí)能在一定程度上抑制脂肪酶遷移到油脂表層[28]。CFG、 CFG-WPI混合物以及CFG-WPI Maillard共聚物所穩(wěn)定的姜黃素乳液黏度相差不大（圖4B），因此這幾種乳化劑所形成的姜黃素乳液脂質(zhì)水解速率沒(méi)有明顯差異。

圖7 不同姜黃素乳液經(jīng)過(guò)消化后游離脂肪酸的釋放情況Fig.7 Effects of emulsifiers and particle size of emulsion droplets stabilized by CFG-WPI conjugates on the release of free fatty acids from digested emulsions

為了進(jìn)一步探究姜黃素乳液粒徑對(duì)脂質(zhì)水解的影響，通過(guò)調(diào)控均質(zhì)壓力制備了不同粒徑下的CFG-WPI共聚物穩(wěn)定的姜黃素乳液液滴（0.5～37.3μm）。粒徑對(duì)姜黃素乳液脂質(zhì)水解速率的影響如圖7B所示。粒徑對(duì)姜黃素乳液的脂肪水解速率有著較大的影響，隨著姜黃素乳液粒徑的降低，脂肪水解速率不斷升高。其原因可能是隨著粒徑的降低，液滴的比表面積增大，即油-水界面上脂肪酶進(jìn)行吸附的位點(diǎn)增多，有利于胰脂肪酶的吸附，從而促進(jìn)水解反應(yīng)的進(jìn)行[29]。當(dāng)粒徑減少至0.9 μm時(shí)，其水解速率與0.5 μm時(shí)并無(wú)區(qū)別，說(shuō)明脂肪酸水解反應(yīng)達(dá)到飽和狀態(tài)。

2.7 不同乳化劑及姜黃素乳液粒徑對(duì)姜黃素生物有效性的影響

經(jīng)過(guò)胃腸消化后，通過(guò)測(cè)定消化前后初始姜黃素乳液和膠束中姜黃素的含量，得到不同姜黃素乳液中姜黃素的生物有效性，不同乳化劑類(lèi)型及姜黃素乳液粒徑對(duì)姜黃素生物有效性的影響結(jié)果如圖8所示。其中，單一WPI穩(wěn)定的姜黃素乳液中姜黃素的生物有效性為57%，而CFG穩(wěn)定的姜黃素乳液中姜黃素的生物有效性最高，達(dá)到64%，CFG-WPI Maillard共聚復(fù)合物、 CFG-WPI混合物穩(wěn)定的姜黃素乳液生物有效性分別為58%、61%。說(shuō)明CFG的加入提高了WPI穩(wěn)定的姜黃素乳液中姜黃素的生物有效性，主要原因在于CFG可以起到屏障保護(hù)作用，阻礙胃蛋白酶對(duì)姜黃素乳液的消化[30]，使得更多的姜黃素轉(zhuǎn)移到腸道中。液滴粒徑會(huì)影響姜黃素的生物有效性，當(dāng)姜黃素乳液的粒徑為37.7 μm時(shí)，姜黃素的生物有效性?xún)H為12.9%，當(dāng)粒徑進(jìn)一步降低至15.0～0.5 μm區(qū)間時(shí)，姜黃素乳液中姜黃素的生物有效性為58.0%～63.0%。一方面，較大粒徑的姜黃素乳液不穩(wěn)定，導(dǎo)致姜黃素的釋放量較高；另一方面，甘油三酯經(jīng)水解后產(chǎn)生FFA，F(xiàn)FA可與膽鹽協(xié)同包埋姜黃素產(chǎn)生膠束、囊泡、脂質(zhì)體等結(jié)構(gòu)，促進(jìn)姜黃素的吸收。同時(shí)，當(dāng)粒徑較大時(shí)，釋放出的FFA較少，不利于形成包埋姜黃素的膠束結(jié)構(gòu)，因此導(dǎo)致較低的生物有效性。姜黃素乳液粒徑較小時(shí)，有助于抑制油滴的聚集，從而增加了包埋物姜黃素的生物有效性。

圖8 不同姜黃素乳液中姜黃素的生物有效性Fig.8 Bioavailability of curcumin-loaded O/W emulsions

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)Maillard反應(yīng)制備了CFG-WPI Maillard共聚復(fù)合物，通過(guò)SDS-PAGE和FTIR驗(yàn)證了共價(jià)復(fù)合物的形成。與單一CFG、WPI穩(wěn)定的姜黃素乳液相比， CFG-WPI Maillard共聚物降低了姜黃素乳液的粒徑，提高了體系的黏度，而且改善了姜黃素乳液對(duì)外界環(huán)境因子pH值、Ca2+濃度的敏感性。姜黃素乳液穩(wěn)定性改善的主要原因在于CFG-WPI Maillard共聚物具有更大的空間位阻和靜電斥力，從而有效地抑制了油滴的絮凝聚結(jié)。此外，CFG-WPI Maillard共聚物顯著提高了姜黃素的包埋率。消化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CFG在一定程度上能夠抑制脂質(zhì)的水解，且姜黃素乳液粒徑是影響脂質(zhì)水解速率的重要因素。與單一WPI穩(wěn)定的姜黃素乳液相比，CFG的添加在一定程度上能提高姜黃素的生物有效性。對(duì)于CFG-WPI Maillard共聚物穩(wěn)定的姜黃素乳液而言，較小的乳液粒徑有助于改善姜黃素的生物有效性。