王雅杰，王 嘉，岳洪娟，竇亞平，李 娜

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率高、致死率高，嚴重威脅人類健康。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子非編碼單鏈RNA，其異常表達與多種疾病密切相關。研究發(fā)現COPD患者肺組織多種miRNA上調，可能影響缺氧誘導因子-1α相關的肺結構修復程序，與COPD發(fā)病機制有關。母親信號蛋白同源物(mothers against decapentaplegic homolog，Smad)蛋白家族是轉化生長因子β家族(transforming growth factor-βs，TGF-βs)的重要底物，分為受體激活型、通用型和抑制型三種，Smad7是抑制型Smad，可以選擇性抑制TGF-βs信號通路。研究發(fā)現COPD患者肺組織Smad7表達下調，且與氣道壁厚度、氣道平滑肌厚度呈負相關。miR-181a在COPD中是否通過調控Smad7發(fā)揮作用，尚不清楚，該研究通過建立COPD大鼠模型，探討miR-181a是否通過調控Smad7對COPD大鼠氣道重塑發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

實驗動物 清潔級SD雄性大鼠80只，8周齡，體質量200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0005。大鼠購入后于清潔通風環(huán)境中適應性飼養(yǎng)7 d，溫度20～26 ℃，濕度40%～60%，明暗周期12 h/12 h循環(huán)。

1.1.2

主要試劑與儀器 miR-181a mimics、miR-181a inhibitors、control mimics(廣州市銳博生物科技有限公司)，脂多糖(北京索萊寶公司，批號：224R032)，大前門牌香煙(上海煙草公司)，兔抗大鼠基質金屬蛋白酶-9(matrix metallo proteinase，MMP-9)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)單克隆抗體、兔抗大鼠Smad7、p-Smad7多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(美國Abcam公司)，ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)，SA-ALC-V8S小動物呼吸機(北京中西華大科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1

建模與分組 80只大鼠隨機取65只參考黃文鋒 等的方法建立COPD大鼠模型，分別于第1、15 天氣管內注入200 μl脂多糖溶液(1 g/L)，并且于第2～28天(除第15天)將大鼠置于留有兩個通氣孔的72 L玻璃箱中被動吸煙，每次30 min，每天2次，間隔8 h，每天12支煙。4周后，所有大鼠腹腔注射30 mg/kg的3%戊巴比妥鈉麻醉后，固定頭部及四肢，正中切開氣管、插管，然后將大鼠仰臥于小動物呼吸機支撐板上，氣管插管與體描箱氣路相連，氣道壓力曲線顯示正常后，關閉體描箱，測量氣體壓力變化，間接獲取肺容積變化，計算機處理后得到肺功能指標，計算第一秒用力呼氣量(forced expiratory volume，FEV)占用力肺活量(forced vital capacity，FVC)的比值，FEV/FVC<70%即為建模成功。將建模成功的56只大鼠隨機分為模型組、mimics組、inhibitors組、NC組，各14只，剩余15只大鼠為假手術組。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.2.2

干預方法 建模2 h后進行干預，mimics組尾靜脈注射miR-181a mimics，inhibitors組尾靜脈注射miR-181a inhibitors，NC組尾靜脈注射control mimics，注射速度1 μl/min，共注射10 μl。假手術組、模型組尾靜脈注射10 μl生理鹽水。

1.2.3

組織取材 干預24 h后，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，腹主動脈穿刺放血后處死，開胸暴露雙肺，分離左肺和右肺組織。各組取7只大鼠右肺組織，10%甲醛固定液內清洗并浸泡30 min，放進40%甲醛溶液中固定備用。其余右肺剪取前葉、中葉及后葉，用無菌紗布蘸去表面的血跡，加入生理鹽水用勻漿器制備肺組織勻漿，3 000 r/min，離心半徑8 cm，離心15 min，留取上清液-20 ℃保存。所有左肺剔除肺外組織，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2.4

RT-qPCR檢測肺組織miR-181a、Smad7 mRNA相對表達水平 取-80 ℃保存的左肺組織100 mg，冰上研磨，TRIzol法提取總RNA，檢測RNA的濃度和純度，按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，進行熒光定量PCR，反應體系包括模板cDNA 2 μl，上下游引物各1.5 μl，Taq DNA聚合酶7.5 μl，加雙蒸水至總體積15 μl。反應條件為95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，70 ℃延伸10 s，共45個循環(huán)，分別以U6和GDPAH為內參基因，依據2法計算目的基因的相對表達量。引物由擎科生物技術有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5

各組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平檢測 取-20 ℃保存的肺組織勻漿上清液，按照ELISA試劑盒說明書加樣，用全自動酶標儀測定450 nm處的吸光值，通過繪制標準曲線得出IL-1β和TNF-α的濃度。

1.2.6

熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-181a對Smad7的靶向性 首先使用靶基因預測數據庫TargetScan,miRanda和PicTar預測miRNA-181a的靶基因，結合文獻研究、基因序列及功能挑選預測值較高的靶點(即Smad7)進行驗證。構建野生型及突變型Smad7基因3′-UTR-熒光素酶表達載體，接種支氣管上皮細胞于24孔板中，待細胞培養(yǎng)至融合度約為60%，用Lipofectamine 2000將野生型或突變型質粒分別與miRNA-181a mimics(miRNA-181a mimics組)和miR-181a inhibitors(miR-181a inhibitors組)共轉染到細胞內，常規(guī)培養(yǎng)48 h，細胞裂解液裂解后，4 ℃，3 600 r/min離心10 min收集上清液，檢測相對熒光素酶活性。

1.2.7

HE染色觀察大鼠肺組織病理學變化 取10%甲醛溶液中固定的右肺組織，在最大橫徑處切2 mm厚的組織塊，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5 μm厚的切片，做蘇木精-伊紅(HE)染色，封片，置于顯微鏡下拍照，用圖像分析軟件測量支氣管壁厚度及支氣管壁膠原纖維厚度。

1.2.8

Western blot檢測肺組織TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相對表達水平 取-80 ℃保存的左肺組織100 mg，加入蛋白提取裂解液，冰上裂解，離心取上清液用BCA蛋白定量試劑盒進行定量，100 ℃水浴使蛋白變性，進行SDS-PAGE凝膠電泳，轉膜，5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，洗膜，加入1 ∶1 000稀釋的TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜后加入1 ∶4 000辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析圖像，以β-actin為內參，TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9相對表達量以各蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白條帶灰度值表示。

2 結果

2.1 各組肺組織miR-181a、Smad7 mRNA相對表達水平

肺組織miR-181a mRNA相對表達水平組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。與假手術組比較，模型組、NC組和inhibitors組miR-181a mRNA相對表達水平降低，mimics組miR-181a mRNA相對表達水平升高(

P

<0.05)；與模型組和NC組比較，mimics組miR-181a mRNA相對表達水平升高，inhibitors組miR-181a mRNA相對表達水平降低(

P

<0.05)；與mimics組比較，inhibitors組miR-181a mRNA相對表達水平降低(

P

<0.05)；模型組和NC組miR-181a mRNA相對表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。肺組織Smad7 mRNA相對表達水平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表2。

表2 肺組織miR-181a、Smad7 mRNA相對表達水平

2.2 各組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平比較

肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。與假手術組比較，模型組、NC組、mimics組、inhibitors組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平升高(

P

<0.05)；與模型組和NC組比較，mimics組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平降低，inhibitors組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平升高(

P

<0.05)；與mimics組比較，inhibitors組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平升高(

P

<0.05)；模型組和NC組肺組織勻漿IL-1β、TNF-α水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表3。

表3 各組肺組織勻漿IL- 1β、TNF-α水平

2.3 miR-181a潛在的靶基因預測

TargetScan在線預測發(fā)現，Smad7 3′-UTR上存在miR-181a的結合位點。見圖1。

圖1 Smad7 3′-UTR與miR-181a的互補序列

采用雙熒光素酶報告基因實驗進一步驗證結果發(fā)現，與Smad7 3′-UTR野生型質粒共轉染時，miR-181a mimics組熒光素酶活性明顯低于miR-181a inhibitors組(

P

<0.05)；與Smad7 3′-UTR突變型質粒共轉染時，miR-181a mimics組和miR-181a inhibitors組熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表4。

表4 支氣管上皮細胞相對熒光素酶活性比較

2.4 各組大鼠肺組織病理學變化

假手術組大鼠肺泡細胞正常，呈空泡狀，薄壁結構，小支氣管無腺體及炎性細胞浸潤，無纖維組織增生；模型組、NC組大鼠肺實質破壞，肺泡明顯擴張，相鄰肺泡融合成較大囊腔，氣道管增厚并可見炎性細胞浸潤，大量膠原纖維形成。mimics組肺泡細胞趨于正常，炎癥明顯減輕，膠原纖維明顯減少，肺泡結構紊亂明顯好轉。inhibitors組肺組織病理學變化與模型組和NC組相似。見圖2。

圖2 各組大鼠肺組織病理學變化 HE×400A：假手術組；B：模型組；C：NC組；D：mimics組；E：inhibitors組

2.5 各組大鼠支氣管壁厚度和支氣管壁膠原纖維厚度

支氣管壁厚度和支氣管壁膠原纖維厚度組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。與假手術組比較，模型組、NC組、mimics組、inhibitors組支氣管壁和支氣管壁膠原纖維加厚(

P

<0.05)；與模型組和NC組比較，mimics組支氣管壁和支氣管壁膠原纖維變薄，inhibitors組加厚(

P

<0.05)；與mimics組比較，inhibitors組支氣管壁和支氣管壁膠原纖維加厚(

P

<0.05)；模型組和NC組支氣管壁厚度和支氣管壁膠原纖維厚度比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表5。

表5 各組大鼠支氣管壁厚度和支氣管壁膠原纖維厚度

2.6 肺組織TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相對表達水平比較

肺組織TGF-β1、p-Smad7、MMP-9蛋白相對表達水平組間比較，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.05)。與假手術組比較，模型組、NC組、mimics組和inhibitors組肺組織TGF-β1、MMP-9蛋白相對表達水平升高，p-Smad7蛋白相對表達水平降低(

P

<0.05)；與模型組和NC組比較，mimics組肺組織TGF-β1、MMP-9蛋白相對表達水平降低，p-Smad7蛋白相對表達水平升高，inhibitors組肺組織TGF-β1、MMP-9蛋白相對表達水平升高，p-Smad7蛋白相對表達水平降低(

P

<0.05)；與mimics組比較，inhibitors組肺組織TGF-β1、MMP-9蛋白相對表達水平升高，p-Smad7蛋白相對表達水平降低(

P

<0.05)；模型組和NC組肺組織TGF-β1、p-Smad7、MMP-9蛋白相對表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。肺組織Smad7蛋白相對表達水平組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(

P

>0.05)。見表6，圖3。

表6 肺組織TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相對表達水平

圖3 肺組織TGF-β1、Smad7、p-Smad7、MMP-9蛋白相對表達水平

3 討論

COPD是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎或肺氣腫，可進一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭等常見慢性疾病，其發(fā)病與有害氣體及有害顆粒引起的炎癥反應有關。miRNA通過與其靶向的mRNA堿基互補配對，參與基因轉錄后表達調控，誘導mRNA降解或抑制其翻譯，在生物生長分化、細胞凋亡、炎癥反應中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現miRNA可參與多種肺部疾病的發(fā)病過程，如肺結核、肺癌、COPD、哮喘和特發(fā)性肺間質纖維化等。通過檢測COPD患者組和健康組肺組織中miRNAs的表達情況，發(fā)現COPD患者肺組織中有多種miRNAs異常表達。COPD目前尚缺少有效靈敏的分子標記物，miRNA通過調節(jié)靶基因的表達，參與多種肺部疾病的發(fā)病過程，可以作為早期治療的潛在分子標記物。

miR-181是關鍵的基因表達調控因子，參與生物體免疫、炎癥反應，細胞周期調控、凋亡等過程。最近研究發(fā)現，miR-181a能夠參與肺部炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展，參與肺上皮細胞損傷及炎癥因子形成過程。Du et al發(fā)現在急性肺損傷模型中，miR-181a可以通過下調靶基因Toll樣受體4，負調控THP-1巨噬細胞炎癥因子分泌，與氣道炎癥性疾病有關。李翠娟 等研究發(fā)現 COPD患者血清miR-181a與炎性因子變化密切相關。本研究中mimics組miR-181a mRNA相對表達水平高于其他組，HE染色顯示其肺泡細胞趨于正常、炎癥明顯減輕、膠原纖維明顯減少、肺泡結構紊亂明顯好轉，支氣管壁厚度和支氣管壁膠原纖維厚度較高，且肺組織中IL-1β、TNF-α水平顯著降低，而inhibitors組上述指標與mimics組相反，提示miR-181a可降低COPD模型大鼠炎癥反應，對氣道重塑、肺組織病理形態(tài)有改善作用。

Smad7作為抑制性Smad，能夠被TGF-β誘導，反過來抑制TGF-β，是TGF-β信號通路負調節(jié)劑，Smad7與R-Smad2/3競爭性結合跨膜Ⅰ型絲/蘇氨酸激酶受體抑制受體激活型Smad磷酸化，從而抑制COPD的發(fā)生與發(fā)展。TGF-β是生長因子家族，哺乳動物中有3種亞型，即TGF-β1～3，肺組織中含量最高且具有生物活性的是TGF-β1。MMP-9與COPD發(fā)病密切相關，參與肺組織的損害和重構、促進氣道杯狀細胞增生和黏液表達。張喆 等研究發(fā)現，COPD模型組小鼠肺泡灌洗液中MMP-2、MMP-9、TGF-β1水平顯著上升，說明該時期模型組小鼠發(fā)生氣道重塑。梁珍珍 等研究發(fā)現miR-181a過表達可以緩解IL-1β、IL-6、TNF-α和TGF-β1的生成及IV型膠原蛋白、纖連蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達，從而在COPD氣道重塑中發(fā)揮拮抗作用。模型組MMP-9和TGF-β1表達上調，p-Smad7表達下調，inhibitors組加重了這一現象，而mimics組與模型組和inhibitors組結果相反。本研究中熒光素酶報告基因實驗結果提示：miR-181a通過調控Smad7發(fā)揮作用。以上研究結果提示miR-181a過表達通過促進p-Smad7的表達，抑制MMP-9和TGF-β1表達，改善氣道重塑。

綜上所述，miR-181a對COPD模型大鼠肺組織中氣道重塑有改善作用，可能通過靶向調控Smad7的表達發(fā)揮作用，為臨床治療COPD提供一定理論依據。