邢江浩，郝吉慶

骨肉瘤是一種高度惡性的骨腫瘤，較多發(fā)生于20歲以下的年輕人或者兒童。骨肉瘤因其低存活率而廣為人知，患者的5年生存率僅有20%。與骨肉瘤相關(guān)的病死率較高。當前的骨肉瘤治療策略主要包括化學(xué)療法和外科手術(shù)。然而，治療后患者面臨的最大問題仍是腫瘤的持續(xù)生長；研究顯示，血管生成是骨肉瘤生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，腫瘤中血管網(wǎng)絡(luò)的生成是骨肉瘤增長的關(guān)鍵因素。外泌體是幾乎所有細胞均會釋放的細胞外囊泡。它們可以將內(nèi)容物(如microRNA、lncRNA、蛋白質(zhì)和mRNA)傳輸?shù)绞荏w細胞，從而參與細胞間的各種通訊。腫瘤來源的外泌體已顯示在腫瘤生長的不同時期中發(fā)揮作用，但目前對其中的機制研究較少。miR-301a-3p是近年發(fā)現(xiàn)的一種致癌miRNA，雖然目前已有文獻報道其在多種惡性腫瘤，如胰腺癌、胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及結(jié)直腸癌中高表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且文獻報道其高表達與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。目前尚未有研究其對于骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的作用，該研究擬闡明在骨肉瘤的生長過程中，其來源的外泌體內(nèi)包含的miRNA的作用及可能存在的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細胞株U2-OS和人血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)購自中國科學(xué)院上海細胞庫，U2-OS細胞用McCoy′5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，HUVEC細胞用ECM培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩種培養(yǎng)基均加入有10%的胎牛血清配置，置于 37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2

主要試劑與儀器 McCoy′5A培養(yǎng)基購自上海中喬新舟生物科技公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；CD31、α-SMA、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Mek、p-Mek、Erk、p-Erk等抗體均購自美國Abcam公司；miRNA-301a-3p 模擬物及抑制劑均購自通用生物系統(tǒng)有限公司(中國，安徽)。

1.2 方法

1.2.1

U2-OS分泌的外泌體(U2-Exos)的分離與鑒定 將U2-OS細胞在不含外泌體的高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。在細胞達到完全融合之前，吸出上清液備用。通過在300 r/min，15 min；2 000 r/min，20 min；10 000 r/min，30 min這3個不同轉(zhuǎn)速條件下，超速離心去除上清液中的碎片及細胞，并通過0.2 μm注射過濾器(康寧生命科學(xué)公司，美國)對其進行過濾。隨后，以100 000 r/min轉(zhuǎn)速，超速離心90 min提取外泌體，得到的沉淀物用150 μl PBS溶液重懸。為了鑒定沉淀物是否為外泌體，將提取后的沉淀物在2%戊二醛中浸泡過夜(4 ℃)，次日，PBS反復(fù)沖洗3次，去除其中的液體。隨后用1%鋨酸溶液固定1 h，再用乙醇脫水并用環(huán)氧樹脂包埋。切片機將包埋的材料切成薄片，然后將飽和高碘酸鈉和濃度為0.1 mol/L的鹽酸滴于薄片表面。10 min后，通過100 kV透射電子顯微鏡(HITACHI H-7000 FA，日本)觀察沉淀物的形態(tài)。

1.2.2

外泌體吞噬實驗 PKH26熒光細胞染色試劑盒(Sigma-Aldrich)用于通過標記外泌體膜，從而標記外泌體。在6孔板上每孔接種1.2×10個HUVEC，培養(yǎng)過夜后將已完成標記的外泌體添加至6孔板中。培養(yǎng)12 h后，吸出6孔板中的培養(yǎng)基，2%甲醛固定15 min后PBS溶液洗滌3次；孔中加入1 ∶1 000比例稀釋完成的Actin抗體(碧云天公司，美國)，孵育2 h后吸出抗體，PBS溶液沖洗3次；隨后以1 ∶800比例稀釋熒光二抗，搖床室溫孵育1 h后，PBS溶液沖洗3次。最后，Hoechst(Vector Laboratories，Burlingame，美國)染核，染核后同樣PBS清洗3次；整個過程注意避光處理。共聚焦顯微鏡(LSM780，德國蔡司)觀察和記錄結(jié)果。

1.2.3

腫瘤細胞侵襲實驗 在4 ℃條件下，取出300 μl無血清培養(yǎng)基，并與30 μl基質(zhì)膠混合。在24孔板的其中3個孔各加入100 μl混合溶液，后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。從培養(yǎng)箱中取出腫瘤細胞，胰酶消化后，無血清培養(yǎng)基洗滌3遍后計數(shù)。用無血清培養(yǎng)基清洗上腔室1次后，向每個孔中加入100 μl細胞懸浮液。500 μl無血清培養(yǎng)基添加到下腔室，并在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。小室用PBS洗滌2次，在4 ℃下用5%戊二醛固定，然后用PBS清洗2次。最后，加入0.1%結(jié)晶紫染色并在室溫下孵育30 min。再次用PBS清洗2次后，用棉球輕輕擦拭小室上表面細胞，并在顯微鏡下觀察。

1.2.4

Western blot 對于蛋白質(zhì)印跡分析，使用RIPA溶液裂解細胞，并通過BCA測定法測量每組的蛋白濃度。選擇濃度為5%的濃縮膠以及10%的分離膠，根據(jù)蛋白濃度選擇各組蛋白的上樣量，待電泳完成后，開始轉(zhuǎn)膜，將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；轉(zhuǎn)膜完成后，5%脫脂乳室溫封閉1 h，隨后孵育一抗，4 ℃冰箱過夜；抗體的稀釋比例均為1 ∶1 000；抗CD31、a-SMA、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Mek、p-Mek、Erk、p-Erk。次日吸出一抗，PBS清洗后，二抗室溫孵育2 h，使用Tanon 5200(Tanon科學(xué)技術(shù)有限公司，中國上海)機器對結(jié)果進行分析；使用Image J軟件檢測每個條帶的灰度并進行半定量分析。

1.2.5

細胞轉(zhuǎn)染 用miR-301a-3p mimic(sense:5′-CAGUGCAAUAGUAUUGUCAAAGC-3′;antisense5′- GCUUUGACAAUACUAUUGCACUG-3′)及miR-301a-3p inhibitor(sense：5′- GCUUUGACAAUACUAUUGCACUG-3′)轉(zhuǎn)染U2-OS細胞。隨后，從兩個不同組的培養(yǎng)基中按照先前的方法分離出兩組的外泌體。RNA試劑盒(Omega Bio-Tek，美國)用于從外泌體中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(日本Takara)生成cDNA，并在Bio-Rad CFX Connect實時系統(tǒng)(Bio-Rad)上使用SYBR Green PCR預(yù)混液(日本Takara)進行qRT-PCR，將基因的表達水平相對于內(nèi)部對照(U6)標準化，并使用2方法評估相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1 外泌體鑒定

骨肉瘤細胞產(chǎn)生的外泌體的純度通過透射電子顯微鏡(TEM)和Western blot分析進行驗證。TEM結(jié)果表明，外泌體呈杯狀(圖1A)。通過Western blot法對CD63、flortillin-1和CD9三種蛋白進行了定性及半定量分析，如圖1B顯示，上述三種蛋白在腫瘤細胞上的表達微乎其微，而在外泌體中的表達則較高，這與文獻報道吻合，提示本實驗所提取的沉淀物為外泌體。

圖1 外泌體鑒定A：杯狀的外泌體；B：外泌體表面的標志性蛋白CD63(80 ku)、CD9(35 ku)、Flointin-1(48 ku)表達

2.2 外泌體吞噬研究

本實驗擬明確提取的外泌體是否于HUVEC內(nèi)發(fā)揮作用，而不是在細胞外。免疫熒光染色處理外泌體、HUVEC骨架、HUVEC細胞核，結(jié)果見圖2。紅色熒光外泌體包繞著藍色熒光的HUVEC細胞核，而HUVEC的細胞骨架則呈現(xiàn)綠色熒光；此實驗結(jié)果提示外泌體成功進入HUVEC內(nèi)發(fā)揮作用。

圖2 免疫熒光染色外泌體(紅色)包繞HUVEC細胞核(藍色)，HUVEC細胞骨架呈現(xiàn)綠色熒光，提示外泌體進入HUVEC細胞質(zhì)中

2.3 骨肉瘤細胞侵襲研究

腫瘤細胞侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲增殖能力，結(jié)果見圖3?？瞻捉M、miR-301a-3p抑制劑組、單純骨肉瘤外泌體組、miR-301a-3p模擬物組中骨肉瘤細胞的侵襲能力逐漸增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=20.29，

P

=0.002)。提示miR-301a-3p模擬物在一定程度上增強了腫瘤細胞的侵襲增殖能力。

圖3 骨肉瘤細胞侵襲實驗1:空白組;2:單純骨肉瘤外泌體組;3:miR-301a-3p模擬物組;4:miR-301a-3p抑制劑組;與空白組比較：**P<0.05

2.4 Western blot法檢測

Western blot法結(jié)果顯示見圖4。與空白組、單純骨肉瘤外泌體組以及miR-301a-3p抑制劑這三組比較，miR-301a-3p 模擬物組中的血管生成指標CD31蛋白表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=18.23，

P

=0.003)；α-SMA表達增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

t

=8.373,

P

=0.014)。PI3K/Akt及Mek/Erk信號通路蛋白表達量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，提示miR-301a-3p進入細胞后可能通過激活PI3K/Akt及Mek/Erk兩條信號通路，引起HUVEC的血管相關(guān)蛋白CD31及α-SMA高表達，從而促進成血管化，進一步促進骨肉瘤血管網(wǎng)絡(luò)形成。

圖4 Western blot檢測各組血管相關(guān)及通路蛋白的表達水平1:空白組;2:單純骨肉瘤外泌體組;3:miR-301a-3p模擬物組;4:miR-301a-3p抑制劑組;與空白組比較：**P<0.05

3 討論

研究表明，非編碼RNA在許多生物學(xué)過程中及疾病治療中起著重要作用。miRNA作為非編碼RNA之一在生物中被廣泛發(fā)現(xiàn)。近年來，在腫瘤發(fā)生進展過程中發(fā)現(xiàn)了許多相關(guān)的miRNA。不同的miRNA可以調(diào)節(jié)不同的腫瘤生物過程，包括腫瘤的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移。外泌體，攜帶著包括miRNA在內(nèi)的生物活性分子，通過旁分泌將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)運到附近的細胞并誘導(dǎo)其表型發(fā)生變化。文獻報道腫瘤細胞分泌的外泌體在許多腫瘤中異常表達，包括肺腫瘤、肝腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和骨髓瘤。

目前，骨肉瘤的發(fā)病機制尚不完全清楚，骨肉瘤致癌機制的研究對于預(yù)測患者的預(yù)后和制定患者的治療計劃非常重要。本課題通過一系列實驗驗證了骨肉瘤細胞分泌的外泌體中的miR-301a-3p可能通過PI3K/Akt和Mek/Erk信號通路激活下游分子以參與生物過程，并在腫瘤的增殖、分化、凋亡進程和細胞周期進程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。先前的研究表明，AKT由于具有促進細胞增殖和血管生成的能力而在人類骨肉瘤中高度表達。原因之一是其上游調(diào)節(jié)基因PI3K的異常表達。

本研究在體外實驗中證明，骨肉瘤分泌的外泌體的水平與AKT/p-AKT的水平呈正相關(guān)，表明這其中存在調(diào)節(jié)U2-OS細胞的增殖并促進腫瘤組織中血管生成的某種機制，并為腫瘤細胞提供更多的營養(yǎng)，從而促進腫瘤的生長。本研究中CD31及α-SMA蛋白表達增加，進一步說明miR-301a-3p是整個血管生成過程中的重要一環(huán)。

綜上所述，U2-OS細胞分泌外泌體中的miR-301a-3p可能激活PI3K/Akt和Mek/Erk信號通路，發(fā)揮促進腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用，這可能是骨肉瘤治療的潛在靶點。但是相應(yīng)的體內(nèi)實驗尚未完善，仍有待繼續(xù)探究是否存在更進一步的增強血管生長的機制。