陳彭亮 劉旻 李楨 鄒姒妮 張勇

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）為一種革蘭陰性菌，常見于上消化道，具有傳染性及致病性，是多種慢性消化道疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、MALT淋巴瘤、胃癌等疾病的主要致病因素[1]。全球約有50%的人存在H.pylori感染，我國H.pylori感染率也高達(dá)56.2%[2-3]。兒童期是H.pylori感染的關(guān)鍵時(shí)期，有研究表明，我國有消化道癥狀的兒童H.pylori感染率為29.2%～53.2%，呈逐年遞增的趨勢(shì)[4]，12歲以上感染率顯著上升[5]。因此，兒童幽門螺桿菌感染的治療對(duì)降低H.pylori感染率具有重要意義。目前我國H.pylori感染治療主要以至少兩種抗生素組成的根除治療方法，但隨著根除治療的廣泛開展，幽門螺旋桿菌對(duì)抗生素耐藥的問題也逐漸引起重視，如何合理應(yīng)用抗生素、提高H.pylori感染的根治率已成為臨床醫(yī)生重點(diǎn)關(guān)注的問題。本研究旨在分析東莞地區(qū)H.pylori感染兒童克拉霉素、甲硝唑及阿莫西林的耐藥基因突變情況，并比較不同性別兒童攜帶H.pylori抗生素耐藥基因的差異，為東莞地區(qū)H.pylori感染的治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年12月-2021年1月本院收治的H.pylori感染患兒84例，年齡1～14歲，平均（6.69±2.83）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）13C呼氣試驗(yàn)、胃快速尿素酶檢查確診為H.pylori感染陽性；（2）年齡≤14歲；（3）伴有明顯的消化不良癥狀，包括惡心、嘔吐、腹脹及反酸等；（4）檢查前1個(gè)月內(nèi)未用抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、非甾體消炎藥等藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）活動(dòng)性出血；（2）對(duì)本研究所用藥物有過敏史；（3）存在其他影響本研究結(jié)果的嚴(yán)重疾病，如肝、腎、肺及心等臟器損害等。本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬對(duì)研究?jī)?nèi)容知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 糞便中H.pylori DNA的提取及質(zhì)量控制 稱取200 mg標(biāo)本在冰水中解凍，懸浮于5 ml磷酸鈉緩沖液中，并充分渦旋混勻，放在離心機(jī)離心后取上清液，然后用緩沖液洗滌，加入溶菌酶溶解細(xì)菌后再離心，取沉淀液，此時(shí)沉淀液應(yīng)含有蛋白和核酸等細(xì)菌裂解物，馬上加入苯酚、氯仿溶液，混勻，提取核酸等物質(zhì)，離心后的沉淀物便是核酸提取物，用無水乙醇洗滌沉淀物，晾干后用無菌水溶解，對(duì)提取的DNA溶液取部分用紫外光光度計(jì)檢測(cè)并用細(xì)菌通用序列16sDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳擴(kuò)增物，檢驗(yàn)提取的DNA質(zhì)量。確認(rèn)有DNA后將提取液樣品置于-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 耐藥基因的檢測(cè) 克拉霉素耐藥基因?yàn)?3sRNA，甲硝唑耐藥基因?yàn)閞dxA，阿莫西林耐藥基因?yàn)镻BP1A，獲得3個(gè)基因的引物序列，見表1，對(duì)以上提取的DNA溶液分為3份，分別進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min，72 ℃、5 min。擴(kuò)增目標(biāo)基因的序列后，行瓊脂糖凝膠電泳提純，與標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增的電泳條帶對(duì)比，切割出目標(biāo)基因條帶，此條帶就是目標(biāo)基因序列的PCR產(chǎn)物，對(duì)此產(chǎn)物回收及進(jìn)行Sanger法測(cè)序，并與正?；蛐蛄凶鰿lustal W2對(duì)比，了解有無基因序列的變異。

表1 引物設(shè)計(jì)表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 不同性別患兒感染情況

84例確診為幽門螺旋桿菌感染患兒入組，其中8例患兒糞便標(biāo)本不合格，故不將其納入本研究?jī)?nèi)。因此，最終入組76例H.pylori感染患兒，平均年齡（6.84±2.81）歲，男37例，占48.7%；女39例，占51.3%。

2.2 不同抗菌藥物的耐藥情況

本次研究中，抗菌藥物耐藥基因發(fā)生突變者共46例，基因突變率為60.5%，克拉霉素耐藥基因突變者有29例，基因突變率為38.2%；甲硝唑基因突變者有6例，基因突變率為7.9%；阿莫西林基因突變者有7例，基因突變率為9.2%，發(fā)生兩種以上抗生素基因突變者4例，基因突變率為5.3%，見表2。經(jīng)Pearsonχ2檢驗(yàn)，克拉霉素的耐藥基因突變率高于甲硝唑、阿莫西林耐藥基因突變率及多重耐藥基因突變率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=42.316，P＜0.05）。甲硝唑耐藥基因突變率與阿莫西林耐藥基因突變率相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.084，P＞0.05）。

表2 76例不同抗菌藥物的耐藥情況 例（%）

2.3 抗菌藥物耐藥的性別差異

男、女患兒的克拉霉素、甲硝唑、阿莫西林的耐藥基因突變率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 抗菌藥物耐藥的性別差異 例（%）

3 討論

H.pylori感染在我國具有較高的感染率，并與多種消化系統(tǒng)疾病具有密切聯(lián)系[1]，因其具有傳染性，過高的H.pylori感染率引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注，降低H.pylori感染率已成為亟須解決的公共健康問題。國內(nèi)外多項(xiàng)研究表明，兒童期是H.pylori感染最重要的年齡階段，有2/3的H.pylori感染發(fā)生于10歲以前，因此，根除兒童H.pylori感染可減少消化道相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展[7]。目前，國內(nèi)外H.pylori根除方案中常用的抗生素主要包括甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、四環(huán)素、左氧氟沙星等，兒童可選擇抗生素的種類有限，同時(shí)隨著抗生素在H.pylori感染根除治療中的廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，近年來H.pylori抗生素耐藥問題日趨嚴(yán)重，H.pylori感染的根治率也不斷下降。因此，如何在治療過程中提高Hp根除率，避免耐藥菌的產(chǎn)生，成為一項(xiàng)重要的研究議題。

成人H.pylori感染研究資料顯示，克拉霉素及甲硝唑的耐藥率在全國范圍均比較高，不同國家不同地區(qū)對(duì)抗生素的耐藥性均存在不同程度的差異[8]。H.pylori對(duì)克拉霉素耐藥主要由23SrRNA基因Ⅴ功能域的點(diǎn)突變引起，導(dǎo)致克拉霉素與核糖體亞基的結(jié)合力下降，不能阻斷肽鏈的延伸，從而無法達(dá)到殺菌目的[9]，常見的點(diǎn)突變位點(diǎn)為A2143G、A2142G及A2142C[10]。H.pylori對(duì)甲硝唑的耐藥機(jī)制主要為rdxA基因突變，其突變導(dǎo)致NADPH還原酶活性降低，從而產(chǎn)生耐藥[9]。PBP1突變是阿莫西林耐藥基因突變的常見形式，通過轉(zhuǎn)移青霉素結(jié)合基序影響H.pylori對(duì)阿莫西林的耐藥性[11]。但阿莫西林作為臨床常用藥物，H.pylori對(duì)其耐藥性卻顯示出與其既往用藥史無明顯相關(guān)性，提示H.pylori對(duì)阿莫西林繼發(fā)性耐藥發(fā)生率較低[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)H.pylori感染患兒對(duì)克拉霉素、甲硝唑及阿莫西林均有不同程度的耐藥基因突變情況出現(xiàn)，其中克拉霉素耐藥基因突變率為38.2%；甲硝唑耐藥基因突變率為7.9%；阿莫西林耐藥基因突變率為9.2%，多重耐藥基因突變率為5.3%，以克拉霉素耐藥基因突變率高于其余抗生素耐藥基因突變率，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示東莞地區(qū)可能屬于克拉霉素高耐藥地區(qū)。其原因可能在于克拉霉素突變位點(diǎn)較多，容易發(fā)生突變，導(dǎo)致較高的耐藥基因突變率。由于甲硝唑劑型及患兒依從性的問題，臨床上較少選擇甲硝唑?qū)和M(jìn)行相關(guān)疾病的治療，以致于該地區(qū)兒童對(duì)甲硝唑的耐藥性普遍較低，這可能是本次研究中甲硝唑耐藥基因突變率較低的原因；此外，也有研究表明，除了rdxA基因突變以外，frxA基因突變也與甲硝唑耐藥形成相關(guān)[12]，還需進(jìn)一步分析甲硝唑的耐藥機(jī)制。本次研究中也得出阿莫西林耐藥基因突變率較低的結(jié)論，與任小舟等[9]研究結(jié)果相符合。同時(shí)，本次研究也出現(xiàn)克拉霉素和甲硝唑耐藥基因同時(shí)存在情況，提示在H.pylori感染的治療中，需充分考慮多重耐藥的因素。

本研究通過分析不同抗菌藥物耐藥性的性別差異發(fā)現(xiàn)，克拉霉素、甲硝唑及阿莫西林的耐藥性與H.pylori感染患兒的性別無關(guān)，原因可能在于本研究?jī)H納入兒童H.pylori感染患兒，年齡段比較局限，該結(jié)論與前期文獻(xiàn)[13]研究一致，未來將進(jìn)一步分析抗生素耐藥基因突變與H.pylori感染根除治療的關(guān)系。同時(shí)，本研究仍存在一些不足，如樣本量較少，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量探討該地區(qū)的兒童H.pylori感染現(xiàn)狀及攜帶耐藥基因狀況。

綜上所述，東莞地區(qū)H.pylori感染患兒抗生素耐藥基因突變主要以克拉霉素耐藥基因?yàn)橹?，其可能影響H.pylori感染的治療，且在后續(xù)治療中應(yīng)充分考慮雙重耐藥的因素。