石帥帥， 席 毅， 倪 賀， 呂鎮(zhèn)城， 陳兆貴， 李海航*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院∥廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631; 2. 惠州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院， 惠州 516007)

甘薯(IpomoeabatatasLan)為旋花科的食藥兩用植物. 據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)2015年的統(tǒng)計(jì)，中國(guó)的甘薯種植面積約為560萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量約1億t，分別占世界的70%和85%[1]. 甘薯除含有大量淀粉外，還含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括維生素、多酚、花色素苷、β-胡蘿卜素、黃酮、粘液蛋白、去氫表雄酮，食用纖維等[2-6]. 甘薯具有多方面的藥理功能，包括降血糖、降血脂、減肥、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗菌性、抗氧化和抗突變等[7-12].

我國(guó)甘薯產(chǎn)量約50%用于加工生產(chǎn)淀粉，加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的廢水和廢渣. 這些廢渣未被利用，造成巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[13]. 據(jù)報(bào)道，每生產(chǎn)1 t甘薯淀粉大約產(chǎn)生1.3 t甘薯渣. 甘薯渣中殘留的淀粉含量可高達(dá)其干質(zhì)量的61%[14]，具有較高的利用價(jià)值. 近年來(lái)，對(duì)于甘薯渣資源的開(kāi)發(fā)利用研究主要集中在制備膳食纖維、糖漿，或者用來(lái)發(fā)酵制備乙醇、氫氣等[15-18].

本課題組研究和開(kāi)發(fā)出了甘薯廢水中全部生化成分的高效和高價(jià)值分離回收方法和工藝[3-5]. 本研究采用酶解法將甘薯渣中的淀粉完全水解成葡萄糖，并經(jīng)過(guò)除雜和結(jié)晶得到超高純度的藥用級(jí)結(jié)晶葡萄糖，水解后的剩余物加入纖維素酶處理，可制備含可溶性膳食纖維較高的纖維制品，為甘薯渣的高價(jià)值利用提供了切實(shí)可行的方法.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)用甘薯品種為一點(diǎn)紅(產(chǎn)地廣東)，購(gòu)自廣州白云區(qū)江南果蔬批發(fā)市場(chǎng). 葡萄糖標(biāo)品和糖化酶(10萬(wàn)U/g)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司. 耐高溫α-淀粉酶購(gòu)自麥克林公司. 95%乙醇(食用級(jí))購(gòu)自廣州成碩化玻有限公司. 乙腈為色譜級(jí)，購(gòu)自Honeywell Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA)；其他化學(xué)試劑均為分析純或者生化試劑，購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠.

1.2 葡萄糖的定量分析

用高效液相色譜儀對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量分析. 檢測(cè)器為示差折光檢測(cè)器；液相色譜柱為Hpersil APS-2 NH2柱(4.6×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=85∶15；流速0.75 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)量為10 μL. 用不同質(zhì)量濃度的超高純結(jié)晶葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(10、20、30、40、50 g/L)制作質(zhì)量濃度和峰面積之間的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的峰面積計(jì)算樣品中葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液與其峰面積之間關(guān)系的線性回歸方程為：y=75.797x-8.57，R2=0.999 9. 在此條件下，葡萄糖可與其它單糖類物質(zhì)達(dá)到良好的基線分離，葡萄糖在10～50 g/L的范圍內(nèi)的質(zhì)量濃度和峰面積之間有良好的線性關(guān)系.

1.3 酶解條件的優(yōu)化

稱取20 g新鮮的濕甘薯渣，加入1倍體積的水和一定量耐高溫α-淀粉酶，加熱液化一定時(shí)間后再加入糖化酶酶解一定時(shí)間，在室溫下5 000 r/min離心10 min，取上清液得到酶解葡萄糖溶液，測(cè)定其葡萄糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù).

1.4 酶解葡萄糖的純化

配制500 g/L的酶解葡萄糖溶液，分別加入1%、2%、3%、4%和5%的大孔樹(shù)脂或聚酰胺，攪拌吸附3 h后離心，分離出溶液. 用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描溶液的吸收光譜. 根據(jù)溶液的吸光強(qiáng)度分析溶液中雜質(zhì)的脫除效果.

1.5 葡萄糖的結(jié)晶

配制不同質(zhì)量濃度的酶解葡萄糖溶液，在65 ℃下加熱30 min，加入少量的葡萄糖晶種，超聲處理20 min后，在4 ℃下結(jié)晶. 結(jié)晶出的葡萄糖用少量95%乙醇洗去微量殘留的雜質(zhì)，在真空干燥箱中烘干.

1.6 酶解制備可溶性膳食纖維

取1 g水解后的殘?jiān)煞郏尤?5 mL的0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 4)，再加入纖維素酶，加熱保溫一段時(shí)間后8 000 r/min離心10 min，上清液加入4倍體積95%乙醇，沉淀過(guò)夜，離心分離. 沉淀即為可溶性膳食纖維.

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差.

2 結(jié)果分析與討論

2.1 α-淀粉酶酶解條件的優(yōu)化

測(cè)定了α-淀粉酶添加量對(duì)酶解液中葡萄糖產(chǎn)生的影響. 酶添加量在10～50 U/g范圍內(nèi)(圖1A)，酶解的葡萄糖量隨α-淀粉酶的增加而有所提高，但增加的幅度不大. 酶添加量為10、50 U/g時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度分別為59.1、68.2 g/L，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮到工業(yè)生產(chǎn)時(shí)酶的成本較高，選擇α-淀粉酶的用量為20 U/g.

在60～90 ℃范圍內(nèi)，隨著液化溫度的增加，酶解液中的葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸增加，從60 ℃時(shí)的56.5 g/L增加到90 ℃時(shí)65.5 g/L(圖1B). 但當(dāng)液化溫度進(jìn)一步升高到100 ℃時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度不再增加, 加熱溫度為60 ℃和90 ℃的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 因此，選擇90 ℃作為α-淀粉酶液化的最適溫度.

在上述優(yōu)化的α-淀粉酶添加量和90 ℃的酶解溫度下，測(cè)定了酶解時(shí)間對(duì)葡萄糖產(chǎn)生量的影響(圖1C). 當(dāng)液化時(shí)間為30 min時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為62.0 g/L，隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸增大，當(dāng)液化時(shí)間為60 min時(shí)，葡萄糖質(zhì)量濃度達(dá)到65.8 g/L. 此后再延長(zhǎng)液化時(shí)間，溶液中的葡萄糖質(zhì)量濃度不再增加，表明淀粉已經(jīng)完全被液化. 酶解60 min為α-淀粉酶液化的最佳時(shí)間.

圖1 甘薯渣酶解制備葡萄糖的液化條件優(yōu)化

2.2 糖化酶酶解條件的優(yōu)化

研究和優(yōu)化了糖化過(guò)程中糖化酶的加入量、酶解溫度和酶解時(shí)間. 當(dāng)糖化酶的加入量為100 U/g時(shí)(圖2A)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為51.1 g/L，當(dāng)糖化酶的加入量增加到200、300和400 U/g時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度變化不大，分別為52.3、53.8、54.0 g/L. 當(dāng)糖化酶的加入量為500 U/g時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度有較大的提高，達(dá)到57.8 g/L. 糖化酶加入量為500 U/g，與其他組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮到大量生產(chǎn)時(shí)酶的成本較高，選擇300 U/g作為糖化酶的用量.

測(cè)定了40～80 ℃的溫度范圍內(nèi)糖化酶的糖化效果. 在40 ℃時(shí)(圖2B)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為46.9 g/L. 隨著溫度的升高，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度逐漸增加. 當(dāng)糖化溫度為60 ℃時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度達(dá)到最高(49.7 g/L). 此后，隨著溫度的升高，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度則迅速降低,酶解溫度為80 ℃時(shí)與其他組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 60 ℃為糖化酶處理的最佳溫度.

當(dāng)糖化時(shí)間為3 h(圖2C)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為41.2 g/L,延長(zhǎng)糖化時(shí)間到6、9、12 h時(shí)，酶解液中葡萄糖的質(zhì)量濃度變化不大，約為43 g/L. 當(dāng)糖化時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到24 h時(shí)，酶解液中麥芽糖的質(zhì)量濃度仍有少量的增加，至46.8 g/L. 加熱3 h與24 h之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,考慮到工業(yè)生產(chǎn)時(shí)的效率，選擇糖化酶的糖化時(shí)間為6 h. 如條件許可，糖化時(shí)間可延長(zhǎng)至24 h.

圖2 甘薯渣酶解制備葡萄糖的糖化條件優(yōu)化

2.3 葡萄糖的純化

水解后的糖溶液含有非糖類雜質(zhì)，呈淺黃色. 因?yàn)樘穷愇镔|(zhì)在紫外區(qū)沒(méi)有吸收峰，可以通過(guò)紫外吸收光譜來(lái)檢測(cè)溶液中非糖類物質(zhì)的脫除效果. 實(shí)驗(yàn)測(cè)定和比較了在糖溶液中加入不同量的聚酰胺和大孔樹(shù)脂對(duì)溶液中非糖類物質(zhì)的吸附脫除效果(圖3A、B). 大孔樹(shù)脂吸附有紫外吸收的雜質(zhì)的效果顯著優(yōu)于聚酰胺吸附效果. 大孔樹(shù)脂在添加量為1%、2%、3%、4%和5%時(shí)都能顯著降低水解液的紫外吸收，但隨著大孔樹(shù)脂用量的增加，葡萄糖的損失也逐漸增加. 綜合考慮吸附除雜效果和葡萄糖的損失，選擇在水解后的葡萄糖溶液中加入1%的大孔樹(shù)脂，除去大部分非糖類雜質(zhì)，此時(shí)葡萄糖的損失很少.

圖3 聚酰胺和大孔樹(shù)脂吸附除去酶解葡萄糖溶液雜質(zhì)的效果

2.4 結(jié)晶制備超高純度葡萄糖

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了酶解葡萄糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葡萄糖晶種的加入量和結(jié)晶時(shí)間對(duì)葡萄糖結(jié)晶效果的影響. 當(dāng)酶解葡萄糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時(shí)(圖4A)，結(jié)晶得到的葡萄糖純度為97.6%，結(jié)晶回收率為56.3%. 隨著葡萄糖漿質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，結(jié)晶出的葡萄糖的純度及回收率都有所增加，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，結(jié)晶得到的葡萄糖純度為99.1%，回收率達(dá)到89.4%；當(dāng)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到75%時(shí)，盡管結(jié)晶回收率提高至92.8%，但結(jié)晶出的葡萄糖純度則下降到94.3%；當(dāng)葡萄糖溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，無(wú)法結(jié)晶出葡萄糖. 該結(jié)果表明，葡萄糖結(jié)晶的最佳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70%.

測(cè)定了葡萄糖晶種的加入量對(duì)其結(jié)晶效果的影響. 在晶種加入量為1%～5% 的范圍內(nèi)(圖4B)，隨著晶種加入量的增加，結(jié)晶出的葡萄糖純度和回收率沒(méi)有顯著的變化. 結(jié)晶出的葡萄糖純度均達(dá)到99.0%，葡萄糖的回收率均為92.0%. 據(jù)此，確定在葡萄糖結(jié)晶時(shí)晶種的加入量為1%.

在12～96 h范圍內(nèi)(圖4C)，測(cè)定了結(jié)晶時(shí)間對(duì)葡萄糖結(jié)晶效果的影響. 當(dāng)結(jié)晶時(shí)間為12 h時(shí)，結(jié)晶出的葡萄糖純度為97.7%，葡萄糖的回收率為81.7%；隨著結(jié)晶時(shí)間的延長(zhǎng)，結(jié)晶出的葡萄糖純度略有提高，回收率亦有顯著的增加；當(dāng)結(jié)晶時(shí)間為48 h時(shí)，得到的葡萄糖純度為99.3%，糖的回收率達(dá)到91.1%；此后，繼續(xù)延長(zhǎng)結(jié)晶時(shí)間，結(jié)晶出的葡萄糖純度和回收率均無(wú)顯著變化. 因此，葡萄糖結(jié)晶的最佳時(shí)間為48 h.

圖4 葡萄糖結(jié)晶條件的優(yōu)化

2.5 制備可溶性膳食纖維條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了纖維素酶加入量、溶液的pH值、加熱溫度和加熱時(shí)間對(duì)制備高可溶性膳食纖維的影響(圖5). 不加纖維素酶的樣品中僅提取出2%的可溶性膳食纖維(圖5A)；隨著纖維素酶加入量的增加，可溶性膳食纖維的得率增加；當(dāng)纖維素酶加入量為150 U/g時(shí)，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到7.1%；此后，再增加纖維素酶，可溶性膳食纖維的得率趨于不再增加. 因此，確定纖維素酶的最佳加入量為150 U/g.

測(cè)定了溶液的pH對(duì)可溶性膳食纖維含量的影響(圖5B). 溶液的pH為4.0時(shí)，可溶性膳食纖維的得率為10%；隨著溶液pH的升高，樣品中可溶性膳食纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高；pH為5.5時(shí)，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高值20.5%；此后，繼續(xù)升高pH，可溶性膳食纖維得率開(kāi)始下降. 因此，確定溶液的最佳pH為5.5.

隨著反應(yīng)溫度的升高，可溶性膳食纖維的得率先升高后降低(圖5C). 當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高的15.9%；此后，繼續(xù)升高溫度，可溶性膳食纖維的得率則逐漸降低. 因此，確定了酶解反應(yīng)的最適溫度為40 ℃.

隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性膳食纖維的得率逐漸增加(圖5D)，至180 min時(shí)，可溶性膳食纖維的得率達(dá)到最高的16.4%. 此后，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，可溶性膳食纖維的得率趨于穩(wěn)定. 因此，確定酶解反應(yīng)的最佳時(shí)間為180 min.

圖5 可溶性膳食纖維制備條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)確定利用水解后剩余的甘薯殘?jiān)附庵苽浜扇苄陨攀忱w維的最佳條件為：甘薯殘?jiān)尤?50 U/g的纖維素酶，在pH 5.5，反應(yīng)溫度40 ℃的條件下反應(yīng)180 min，此時(shí)殘?jiān)刑崛】扇苄陨攀忱w維的得率由2%提高至20%.

3 討論

甘薯是我國(guó)重要的農(nóng)作物，產(chǎn)量占世界甘薯總產(chǎn)量的80%左右. 我國(guó)的甘薯約一半用于生產(chǎn)淀粉,每生產(chǎn)1 t的淀粉，約產(chǎn)生1.3 t的廢棄甘薯渣. 甘薯渣中含有大量的淀粉、膳食纖維和少量的蛋白質(zhì)，具有潛在的利用價(jià)值. 甘薯渣干質(zhì)量中淀粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均約為40%，可用于制備糖類物質(zhì). 葡萄糖是能夠直接被生物體吸收利用的一種糖類，是人體所需能量的主要來(lái)源. 葡萄糖在醫(yī)藥上不僅可以制成注射液，結(jié)晶葡萄糖還可以用來(lái)生產(chǎn)葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鈣等醫(yī)用產(chǎn)品；在食品中是一種常用的食品添加劑. 膳食纖維是人體第七大營(yíng)養(yǎng)素,在人體中發(fā)揮著重要的作用. 膳食纖維具有改善腸道菌群、降血壓和降血脂等多種生理功能,膳食纖維在食品等方面有著廣泛的應(yīng)用.

孟悅等[16]以玉米粉為原料,通過(guò)高溫酶解法進(jìn)行液化,同時(shí)利用正交試驗(yàn)法對(duì)糖化工藝的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化. 此時(shí),經(jīng)檢測(cè)得到糖化液DE值為98.24%,DX值為98.16%. 吳允山等[17]以甘薯生產(chǎn)淀粉后的殘?jiān)鼮樵?，加入耐高溫?淀粉酶、糖化酶以及纖維素酶對(duì)甘薯渣進(jìn)行處理，然后分別對(duì)其進(jìn)行保溫和滅酶處理，對(duì)固液分離得到的溶液進(jìn)行純化，可以得到葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%左右的糖漿. 最終得到的是葡萄糖漿，沒(méi)有做進(jìn)一步的純化結(jié)晶，同時(shí)酶解制備葡萄糖后剩余的纖維素仍沒(méi)有利用. 孫建等[19]利用超聲波技術(shù)和纖維素酶共同處理甘薯渣，最終制備的樣品中膳食纖維的得率為39.17%，其中可溶性膳食纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅達(dá)到13.49%. 本研究?jī)H利用耐高溫的α-淀粉酶和糖化酶對(duì)甘薯渣中的淀粉進(jìn)行完全水解，并將得到的葡萄糖溶液進(jìn)行純化結(jié)晶制備高純度結(jié)晶葡萄糖. 對(duì)最終剩余的殘?jiān)鼨z測(cè)發(fā)現(xiàn)，其中已經(jīng)不含淀粉，表明甘薯渣中的淀粉完全水解. 剩余的物質(zhì)僅含纖維素，可經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的處理用于含可溶性膳食纖維較高的纖維素制品的開(kāi)發(fā). 本研究在制備高純度結(jié)晶葡萄糖的同時(shí)，又對(duì)甘薯渣廢棄資源進(jìn)行深度的開(kāi)發(fā)利用，既增加甘薯加工產(chǎn)業(yè)附加利潤(rùn)，又減少了甘薯加工生產(chǎn)過(guò)程中造成的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染.

4 結(jié)論

本研究建立和優(yōu)化了甘薯渣酶解制備超高純度結(jié)晶葡萄糖的方法和工藝. 新鮮甘薯渣加等量水混勻，先加入20 U/g的耐高溫α-淀粉酶，在90 ℃下酶解液化60 min；然后加入300 U/g的糖化酶，60 ℃下酶解糖化6 h；甘薯渣中的淀粉可完全水解成葡萄糖,水解后的葡萄糖溶液加入1%的大孔樹(shù)脂吸附除去雜質(zhì)，將溶液的葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)調(diào)節(jié)至70%，65 ℃加熱30 min后，加入1%的葡萄糖晶種，在4 ℃結(jié)晶48 h；結(jié)晶出的葡萄糖用95%乙醇清洗微量殘留雜質(zhì)后，烘干，得到純度為99.0%以上的醫(yī)用級(jí)結(jié)晶葡萄糖；殘?jiān)尤?50 U/g的纖維素酶，在pH 5.5、反應(yīng)溫度40 ℃的條件下反應(yīng)180 min，殘?jiān)刑崛】扇苄陨攀忱w維的得率由2%提高至20%. 本研究為廢棄甘薯渣的高效和高價(jià)值利用提供了可行的方案.