吳 華,閔媛婷,劉立明,石小濤,鄭 軒,胡飛躍,夏志剛,雷克亮,胡雙修?

(1.三峽大學(xué) 第二人民醫(yī)院,宜昌 443000;2.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院,宜昌 443002;3.三峽大學(xué) 水利與環(huán)境學(xué)院,宜昌 443002;4.湖北省黃岡市生態(tài)環(huán)境局麻城市分局,麻城 438300)

蘆丁又稱蕓香苷,化學(xué)名為5,7,3,4-四羥基-3-蕓香糖黃酮,廣泛存在于中草藥中,其在豆科植物槐米、蕓香科植物蕓香草、蓼科植物蕎麥、鼠李科植物光枝勾兒茶及大薊科植物野梧桐中的含量特別高。

蘆丁的顯著特點(diǎn)是具有很強(qiáng)的抗氧化性和清除自由基的能力,因而具有抗衰老、抗基因突變、抗癌等功效。蘆丁還具有鎮(zhèn)咳、利尿、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒和增強(qiáng)免疫力等功能,對(duì)預(yù)防和治療心腦血管疾病、痛風(fēng)和糖尿病等均有顯著療效[1-3]。因此,蘆丁在臨床上用途十分廣泛,具有巨大的藥用價(jià)值。

蘆丁含量的測(cè)定對(duì)其藥劑質(zhì)量控制具有十分重要的意義。檢測(cè)蘆丁的常用方法有電極法[4]、熒光分光光度法[5]、高效液相色譜法等[6]。電極法檢測(cè)儀器便宜,但選擇性差、靈敏度低;熒光光譜法和高效液相色譜法的選擇性較好、靈敏度較高。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)蘆丁的方法有鐵氰化鉀直接氧化蘆丁化學(xué)發(fā)光法[7]、蘆丁增強(qiáng)魯米諾-高錳酸鉀化學(xué)發(fā)光法[8]。化學(xué)發(fā)光分析具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器簡(jiǎn)單、易操作、分析快速等優(yōu)點(diǎn),但選擇性較差[9-12]。本工作將化學(xué)發(fā)光分析與高效液相色譜聯(lián)用來(lái)檢測(cè)蘆丁,較好地彌補(bǔ)了化學(xué)發(fā)光分析選擇性差的缺點(diǎn)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-6A 型高效液相色譜儀;BPCL 型微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x;HL-2型恒流泵;RF-540 型熒光儀;751 型分光光度計(jì);HY-B1型超聲波振蕩器。

魯米諾標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取0.886 0 g魯米諾于500 mL燒杯中,加入1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液20 mL,用水溶解并轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中,定容,搖勻,配制成濃度為1.0×10－2mol·L－1的魯米諾標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃保存,儲(chǔ)存15 d以上再用于試驗(yàn)(儲(chǔ)存15 d以上,其化學(xué)發(fā)光效果好,靈敏度高,而新配制的魯米諾溶液,化學(xué)發(fā)光效果差,靈敏度低)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取0.040 0 g 蘆丁于100 mL燒杯中,用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中,配制成質(zhì)量濃度為0.40 g·L－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃保存。

高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取1.580 3 g高錳酸鉀于100 mL燒杯中,用水溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中,定容,搖勻,配制成濃度為1.0×10－1mol·L－1的高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于4 ℃保存。

蘆丁片劑1～3,規(guī)格25 mg/片,每片0.5 g(換算標(biāo)示量50.00 mg·g－1);所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為去離子二次蒸餾無(wú)酚水(在蒸餾器里加少量高錳酸鉀,使酚類物質(zhì)被高錳酸鉀氧化后揮發(fā),棄去開始0.5 h內(nèi)接收的蒸餾水,隨后接收的蒸餾水將不含酚類)。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫40 ℃;流量1.0 mL·min－1;流動(dòng)相為體積比6∶4的甲醇-2%(體積分?jǐn)?shù),下同)冰乙酸溶液的混合液(即體積比60∶40∶1的甲醇-水-冰乙酸混合液);進(jìn)樣體積20μL。

2)化學(xué)發(fā)光條件 氫氧化鈉-魯米諾混合溶液(其中氫氧化鈉濃度為2.0×10－2mol·L－1,魯米諾濃度為2.0×10－5mol·L－1);1.5×10－4mol·L－1的高錳酸鉀溶液;流量4 cm·s－1;檢測(cè)盤管長(zhǎng)度為10 cm。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 化學(xué)發(fā)光分析與高效液相色譜的聯(lián)用原理

改裝BPCL 型微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x,將流通池盤管正對(duì)檢測(cè)窗,流動(dòng)注射進(jìn)樣。按圖1連接高效液相色譜儀和化學(xué)發(fā)光分析檢測(cè)系統(tǒng)。

圖1 化學(xué)發(fā)光分析與高效液相色譜聯(lián)用流程圖Fig.1 Flow diagram of high performance liquid chromatography coupled with chemiluminescence detection

將氫氧化鈉溶液和魯米諾溶液先經(jīng)三通與高效液相色譜儀出口端混合,流經(jīng)混合管(MC,5 cm),再經(jīng)三通與1.5×10－4mol·L－1高錳酸鉀溶液混合,進(jìn)入流通池盤管(10 cm)。在強(qiáng)堿性條件下,高錳酸鉀氧化魯米諾發(fā)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng),經(jīng)高效液相色譜儀洗脫分離的蘆丁對(duì)該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生增敏作用。BPCL型微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x將檢測(cè)到的流通池盤管中的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào),并輸入聯(lián)用的計(jì)算機(jī)中,計(jì)算機(jī)每0.1 s自動(dòng)采集一個(gè)數(shù)據(jù),以峰高定量。根據(jù)蘆丁的質(zhì)量濃度與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度信號(hào)的峰高建立線性回歸方程。

流動(dòng)相、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、蘆丁樣品溶液需經(jīng)0.45μm 濾膜過(guò)濾、超聲波振蕩器振蕩去氣泡,靜置30 min后使用。

1.3.2 樣品的測(cè)定

將市售蘆丁片劑在干燥器中干燥8 h后,于研缽中研磨成粉末,稱取1.00 g蘆丁粉末于索氏提取器中,加入100 mL甲醇后,回流加熱5 h,提取液經(jīng)0.45μm 濾膜抽濾,超聲波振蕩器振蕩去氣泡,靜置30 min,制得待測(cè)樣品溶液。用20μL進(jìn)樣器進(jìn)樣,按上述儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

在流量為1.0 mL·min－1、流動(dòng)相為體積比6∶4的甲醇-2%冰乙酸溶液的混合液的條件下,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和蘆丁樣品溶液的色譜圖見圖2。

由圖2可知,蘆丁的保留時(shí)間為6.20 min,在上述色譜條件下,蘆丁具有較好的分離效果。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和蘆丁樣品溶液的色譜圖Fig.2 Chromatograms of rutin standard solution and rutin sample solution

2.2 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)條件的選擇

2.2.1 氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度

由于高錳酸鉀氧化魯米諾產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光反應(yīng)需要在pH 大于12的強(qiáng)堿性介質(zhì)中進(jìn)行,而甲醇-冰乙酸流動(dòng)相體系為酸性,因此可通過(guò)增大氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度,使流通池盤管中混合液pH 大于12。

試驗(yàn)緩慢增大氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度,并同步檢測(cè)流通池盤管中混合液的酸度。結(jié)果表明,當(dāng)氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度增大至2.0×10－2mol·L－1時(shí),流通池盤管中混合液的pH 剛好達(dá)到12,因此試驗(yàn)選擇氫氧化鈉-魯米諾混合溶液中氫氧化鈉的濃度為2.0×10－2mol·L－1。

2.2.2 魯米諾的濃度

試驗(yàn)考察了魯米諾的濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 魯米諾濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of concentration of luminol on intensity of chemiluminescence

由圖3可知:當(dāng)魯米諾的濃度較低時(shí),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨魯米諾濃度的增大而增大;當(dāng)魯米諾的濃度超過(guò)2.0×10－5mol·L－1時(shí),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨魯米諾濃度的增大而降低,這可能是因?yàn)轸斆字Z對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光子有吸收作用[12],從而導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。因此,試驗(yàn)選擇魯米諾濃度為2.0×10－5mol·L－1。

2.2.3 高錳酸鉀的濃度

試驗(yàn)考察了高錳酸鉀的濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響,結(jié)果見圖4。

圖4 高錳酸鉀濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of KMn O4 concentration on intensity of chemiluminescence

由圖4可知:當(dāng)高錳酸鉀的濃度較低時(shí),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨高錳酸鉀濃度的增加而增大;當(dāng)高錳酸鉀的濃度超過(guò)1.5×10－4mol·L－1時(shí),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著高錳酸鉀濃度的增大而降低,這可能是因?yàn)楦咤i酸鉀的分解產(chǎn)物二氧化錳沉淀物對(duì)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生的光子有散射作用,導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度降低。因此,試驗(yàn)選擇高錳酸鉀的濃度為1.5×10－4mol·L－1。

2.2.4 檢測(cè)盤管與三通閥之間的距離以及長(zhǎng)度的選擇

靜態(tài)化學(xué)發(fā)光動(dòng)力曲線結(jié)果表明,化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度瞬時(shí)能達(dá)到較大值,0.5 s達(dá)到最大值,3 s后降至空白值。發(fā)光試劑與流動(dòng)相混合處和檢測(cè)盤管(檢測(cè)盤管是流通池盤管的一部分)之間的接頭距離約2 cm,流量為4 cm·s－1,則此段耗時(shí)0.5 s,而該化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是快速反應(yīng),0.5 s時(shí)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度達(dá)最大。因此,為了盡可能檢測(cè)到強(qiáng)發(fā)光時(shí)段的化學(xué)發(fā)光信號(hào),這就要求檢測(cè)盤管與三通閥之間的距離盡可能短,試驗(yàn)將盤管固定在三通閥下底。

增加檢測(cè)盤管的長(zhǎng)度有利于檢測(cè)到更多的光子信號(hào),提高靈敏度及檢出限,但檢測(cè)盤管不宜過(guò)長(zhǎng),否則色譜峰展寬,使得峰高降低?；瘜W(xué)發(fā)光持續(xù)時(shí)間為3 s,流量為4 cm·s－1,故盤管不宜超過(guò)12 cm。在相同條件下,分別選擇盤管長(zhǎng)度為6,7,8,9,10,11,12 cm 進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明,盤管長(zhǎng)度10 cm 時(shí)測(cè)得的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度較大,因此試驗(yàn)選擇檢測(cè)盤管長(zhǎng)度為10 cm。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在上述色譜條件和優(yōu)化的化學(xué)發(fā)光條件下,對(duì)質(zhì)量濃度分別為1.00,10.00,50.00,100.00,150.00μg·L－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定。以蘆丁的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,蘆丁的質(zhì)量濃度在1.00～150.00μg·L－1內(nèi)與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝18.70x＋16.30,相關(guān)系數(shù)為0.999 2。

以線性范圍的下限作為檢出限,則該方法的檢出限為1.00×10－6g·L－1。將本方法所得的檢出限與文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行比對(duì),結(jié)果見表1。

表1 不同方法比對(duì)結(jié)果Tab.1 Comparison of results by different methods

由表1可知,本方法具有較低的檢出限。

2.4 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法測(cè)定50.00μg·L－1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,平行測(cè)定11次,并計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果表明,測(cè)定值的RSD 為2.7%,說(shuō)明方法具有較好的精密度。

按試驗(yàn)方法對(duì)市售蘆丁片劑1～3(標(biāo)示量50.00 mg·g－1)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定值分別為48.60,47.40,48.00 mg·g－1,說(shuō)明測(cè)定值與標(biāo)示量吻合。對(duì)上述樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)樣品平行測(cè)定5次,計(jì)算回收率,結(jié)果見表2。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝5)Tab.2 Results of test for recovery(n＝5)

本工作建立了化學(xué)發(fā)光分析與高效液相色譜聯(lián)用檢測(cè)蘆丁的方法,該方法操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高,能準(zhǔn)確地測(cè)定實(shí)際樣品中蘆丁的含量。