林守二,鄭仁錦,華永有,黃麗英

(1.福建省疾病預(yù)防控制中心 福建省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福州 350001;2.福建醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院,福州 350004)

豆芽具有健脾養(yǎng)肝、清熱解毒等作用,同時(shí)含有蛋白質(zhì)、維生素、糖類以及多種礦物質(zhì)[1-2]。然而,一些不法商販為牟取高額利潤(rùn),在豆芽生產(chǎn)過(guò)程中濫用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(PGRs),企圖增加豆芽產(chǎn)量、改變外觀、縮短生長(zhǎng)周期等,以致“毒豆芽”事件頻出[3]。人體攝入PGRs短期內(nèi)影響不大,但長(zhǎng)期食用可能導(dǎo)致各種疾病,輕者刺激黏膜、惡心、嘔吐等,重者引起肢端肥大、骨質(zhì)疏松、非霍奇金淋巴瘤等[4]。

豆芽中PGRs種類較多,殘留量低,基質(zhì)復(fù)雜,檢測(cè)難度較大。目前,用于PGRs檢測(cè)的前處理方法主要包括液液萃取、加速溶劑萃取、超聲波提取、微波輔助萃取及固相萃取等[5],其中基質(zhì)分散固相萃取試劑Qu ECh ERS已成為農(nóng)藥殘留快速前處理技術(shù)的首選[6]。PGRs的檢測(cè)方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、毛細(xì)管電泳色譜法及酶聯(lián)免疫法等[7-13]。其中超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)在測(cè)定植物中農(nóng)藥殘留時(shí),檢出限低,受基質(zhì)干擾小,快速且準(zhǔn)確[14-15]。

目前采用UHPLC-MS/MS測(cè)定豆芽中PGRs的含量已有報(bào)道[16-18],但各文獻(xiàn)所用前處理方法及所檢測(cè)目標(biāo)組分皆有差異,且由于PGRs類化合物各目標(biāo)組分間性質(zhì)差異較大,在多組分同時(shí)檢測(cè)時(shí)選用合適的前處理及檢測(cè)方法尤為重要。本工作以市售32份豆芽為樣本,應(yīng)用QuECh ERS快速前處理方法,同時(shí)對(duì)樣品中12種不同類的PGRs,包括植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑類(生長(zhǎng)素類)的吲哚乙酸、吲哚丁酸、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和4-氯苯氧乙酸,細(xì)胞分裂素類的6-芐氨基嘌呤、噻苯隆、氯吡脲、赤霉素,植物生長(zhǎng)延緩劑類的矮壯素、抗倒酯、烯效唑、多效唑進(jìn)行凈化;結(jié)合UHPLC-MS/MS檢測(cè)技術(shù),對(duì)質(zhì)譜條件的參數(shù)進(jìn)行科學(xué)設(shè)定,實(shí)現(xiàn)了電噴霧離子源(ESI)正負(fù)離子的快速切換,一次進(jìn)樣同時(shí)完成ESI正、負(fù)檢測(cè),建立了同時(shí)測(cè)定豆芽中12種PGRs的方法,可用于市售豆芽的快速檢測(cè),易于普及應(yīng)用,為建立其他食品基質(zhì)中相關(guān)化合物殘留檢測(cè)提供參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

XEVO TQ-XS型超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters I-class 型液相色譜系統(tǒng),UPLC-XEVO TQ-XS 型質(zhì)譜系統(tǒng));Heidolph Multi Reax 型自動(dòng)渦旋混合器;Beckman Coulter Allegra X-30型離心機(jī);QuECh ERS 試劑管(內(nèi)含150 mg無(wú)水硫酸鎂和50 mg C18)。

單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1.00 g·L－1,分別稱取10.00 mg 12種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品,用乙腈配制成質(zhì)量濃度各為1.00 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

單標(biāo)準(zhǔn)溶液:10.0 mg·L－1,移取單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量,用乙腈稀釋配制成質(zhì)量濃度為10.0 mg·L－1的單標(biāo)準(zhǔn)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:500μg·L－1,移取各單標(biāo)準(zhǔn)溶液適量,用乙腈稀釋,混勻,配制成質(zhì)量濃度為500μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱中保存,使用時(shí)用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度。

12種PGRs標(biāo)準(zhǔn)品矮壯素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、烯效唑、多效唑、4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、2,4-D、氯吡脲、赤霉素的純度均大于98%;甲酸、乙腈為色譜純;甲酸銨為優(yōu)級(jí)純;無(wú)水硫酸鎂為分析純。

豆芽樣品采集于福州的某超市及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),所有樣品勻漿后于－18 ℃以下保存?zhèn)錂z。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫30 ℃;流量0.3 mL·min－1;進(jìn)樣量2μL;流動(dòng)相A 為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的5 mmo L·L－1甲酸銨溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～5.0 min時(shí),B由20%升至90%,保持1.0 min;6.0～6.5 min時(shí),B由90%降至20%,保持1.5 min。

2)質(zhì)譜條件 ESI源,離子源溫度150 ℃;毛細(xì)管電壓2.4 k V;脫溶劑氣溫度500 ℃,脫溶劑氣流量800 L·h－1;錐孔電壓22 V;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式;矮壯素、吲哚乙酸、吲哚丁酸、6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、烯效唑、多效唑在電噴霧正離子(ESI＋)模式下檢測(cè);4-氯苯氧乙酸、噻苯隆、2,4-D、氯吡脲、赤霉素在電噴霧負(fù)離子(ESI－)模式下檢測(cè),一次進(jìn)樣同時(shí)完成ESI(±)模式的檢測(cè)。12種PGRs的其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“?”為定量離子。

表1 12種PGRs的質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters of 12 PGRs

1.3 試驗(yàn)方法

稱取5.00 g經(jīng)勻漿后的樣品于50 mL 離心管中,加入體積比1∶99的乙酸-乙腈混合液10 mL,自動(dòng)渦旋振蕩2 min,超聲15 min,以轉(zhuǎn)速6 000 r·min－1離心5min。取上清液1.0mL,加至QuEChERS試劑管內(nèi),渦旋后離心5 min,上清液過(guò)0.22μm 微孔濾膜,按儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

在儀器工作條件下,12種PGRs的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖見圖1。

圖1 12種PGRs的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 12 PGRs

2.2 提取劑的選擇

PGRs的常用提取劑有甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等,在提取過(guò)程中加入少量酸[19]可提高提取效率。試驗(yàn)考察了上述常用提取劑對(duì)12種PGRs提取效果的影響。結(jié)果表明:使用乙腈作為提取劑,各組分均能得到較好的回收率;赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸結(jié)構(gòu)中均含有羧基,酸性溶液抑制羧基在溶液中電離,從而提高提取效率,而乙酸酸性適中,因此最終選用體積比1∶99的乙酸-乙腈混合液作為提取劑。

2.3 凈化劑的選擇

試驗(yàn)比較了N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)和C18等QuECh ERS 試劑的凈化效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn):加入PSA 使得極性較強(qiáng)的矮壯素以及含有羧基的赤霉素、2,4-D、4-氯苯氧乙酸、吲哚乙酸和吲哚丁酸的回收率降低,與文獻(xiàn)[14,20]報(bào)道相符,其原因可能是因?yàn)镻SA 為堿性,對(duì)含有羧酸類的PGRs有吸附作用,故不適合極性較強(qiáng)和含有羧基的PGRs的凈化,適合植物生長(zhǎng)延緩劑類抗倒酯、烯效唑、多效唑的凈化;GCB的加入使得氯吡脲、多效唑和烯效唑的回收率明顯降低;而單獨(dú)加入C18,所有組分的回收率均大于70.0%。因此,試驗(yàn)最終選擇C18作為QuECh ERS試劑管內(nèi)的凈化劑。

2.4 色譜柱的選擇

試驗(yàn)比較了Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(50mm×2.1 mm,1.7μm)和Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm)對(duì)待測(cè)組分的分離效果。結(jié)果表明,12種PGRs在Waters Acquity UPLC?HSST3色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.8μm)上的峰形對(duì)稱,響應(yīng)較好,因此試驗(yàn)選用Waters Acquity UPLC?HSS T3色譜柱。

2.5 質(zhì)譜條件的選擇

配制100μg·L－1的12 種PGRs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別在ESI(±)模式下尋找母離子,并調(diào)試各自最佳錐孔電壓及碰撞能量,尋找各組分的二級(jí)離子,最終選取豐度較高的2個(gè)子離子分別作為定量及定性離子,優(yōu)化后的具體參數(shù)見1.2節(jié)中的質(zhì)譜條件。

2.6 工作曲線和檢出限

12種PGRs均采用基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線法定量分析,以空白基質(zhì)配制基質(zhì)匹配的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以PGRs的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制工作曲線。所得12種PGRs的線性參數(shù)見表2。

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),結(jié)果見表2。

由表2可知:所得相關(guān)系數(shù)均大于0.990 0;檢出限為0.60～6.0μg·kg－1。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.7 精密度和回收試驗(yàn)

分別選擇不含目標(biāo)化合物的黃豆芽和綠豆芽的空白樣品,加入低、中、高等3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,使得矮壯素、6-芐氨基嘌呤、抗倒酯、烯效唑、多效唑、噻苯隆、2,4-D 和氯吡脲的濃度水平為5.00,10.0,50.0μg·kg－1,吲哚乙酸、吲哚丁酸、4-氯苯氧乙酸、赤霉素的濃度水平為10.0,50.0,100μg·kg－1,按試驗(yàn)方法測(cè)定,每個(gè)濃度水平平行測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表3。由表3可知,測(cè)得的回收率為70.0%～110%,RSD 為0.21%～9.8%。

表3 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.8 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)市售32份豆芽樣品進(jìn)行快速檢測(cè),10 份豆芽樣品中檢出PGRs,總檢出率為31.25%,其中檢出組分為吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、4-氯苯氧乙酸、2,4-D 和氯吡脲,具體詳見表4。吲哚乙酸是植物內(nèi)源性生長(zhǎng)素之一,其檢出量較高,但尚未見豆芽中吲哚乙酸含量的報(bào)道。樣品總檢出率相比于其他文獻(xiàn)報(bào)道稍低,但含量范圍與文獻(xiàn)[16-18]測(cè)定值相當(dāng),表明近些年市售豆芽中PGRs的使用控制良好,但仍需持續(xù)監(jiān)測(cè)。

表4 12種PGRs在豆芽中的檢出結(jié)果Tab.4 Results of detection of 12 PGRs in bean sprouts

本工作以體積比1∶99的乙酸-乙腈混合液提取豆芽中12種PGRs,并優(yōu)化選擇以無(wú)水硫酸鎂和C18作為Qu ECh ERS凈化劑對(duì)提取后的樣品進(jìn)行凈化,通過(guò)調(diào)試質(zhì)譜參數(shù)和色譜條件,建立UHPLCMS/MS同時(shí)快速測(cè)定豆芽中12種PGRs的方法。QuEChERS前處理方法操作簡(jiǎn)便、試劑消耗量小、凈化效果好;UHPLC-MS/MS的檢測(cè)方法與傳統(tǒng)液相色譜法相比,極大縮短了分析時(shí)間,適合于大批量樣品的多組分快速篩查與測(cè)定。該方法為快速篩查市場(chǎng)中的“毒豆芽”提供參考。