周衛(wèi)強,李 娟,沈雪梅,彭 超,陳 博,晏禮明,趙黎明,李 義,佟 毅

(1.華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院,上海 200237;2.生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237;3.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司,北京 102209;4.中國科學(xué)院 微生物研究所,北京 100101;5.中糧生物科技股份有限公司,蚌埠 233010;6.玉米深加工國家工程研究中心,長春 130033)

功能性低聚糖作為新的生理活性物質(zhì),在營養(yǎng)保健、畜牧養(yǎng)殖、植物生長調(diào)節(jié)及抗病害等方面具有極大的開發(fā)潛力。低聚殼聚糖,即殼寡糖是一種聚合度(DP)為2～10的氨基葡萄糖低聚化合物,主要來源于海洋蝦蟹殼中的甲殼素,相對于殼聚糖,殼寡糖的水溶性更好、生物活性更強、更易于被吸收利用,具有吸濕保濕、增強免疫、降低血糖及血脂和促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能[1-2]。殼寡糖產(chǎn)品是具有一定聚合度分布的多組分寡糖混合物,生產(chǎn)過程中通常采用膜分離和色譜分離等方式進行除雜和提純,以進一步縮小其聚合度分布范圍[3]?，F(xiàn)有研究表明,殼寡糖的生物功能與其聚合度緊密相關(guān)[4-5],殼寡糖聚合度高低與分布水平將直接影響其應(yīng)用價值及效果。寡糖是典型的極性分子,具有相似的化學(xué)組成,存在多種可能的異構(gòu)體、多種連接方式和分支結(jié)構(gòu)[6],其分離純化一直是糖生物學(xué)研究中的難點之一。

2019年,全國食品發(fā)酵標準化中心審議并通過了?殼寡糖?行業(yè)標準正式文件[7]?；诎被?250 mm×4.6 mm)或其他同等分析效果的色譜柱,在蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)或者示差折光檢測器(RID)條件下,以高比例乙腈為流動相,可進行殼寡糖含量和聚合度分布的測定。目前主流方法是以Shodex Asahipak NH2P-50 4E 氨基色譜柱(填料為聚乙烯醇微球,修飾多氨基官能團)為固定相,以乙腈-水為流動相進行等度洗脫的高分離度和高靈敏度的高效液相色譜法[8-10]。

此外,日本TOSOH 公司研發(fā)的TSK GEL Amide-80酰胺基修飾的硅膠固定相色譜柱也有相關(guān)應(yīng)用報道[11-12],相比于氨基柱,其鍵合相更穩(wěn)定,具有更好的親水性。在脈沖安培檢測器(PAD)支持下,使用Dionex 公司生產(chǎn)的CarboPac PA10 低容量陰離子交換色譜柱,亦可分析測定殼寡糖的含量和聚合度分布,并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系[13]。其中,1995年以來,已經(jīng)有多項采用離子色譜-PAD 測定糖類化合物的方法被美國分析化學(xué)組織(AOAC)批準為國際標準[14];而ELSD 靈敏度比RID 高,對溫度變化不敏感,基線穩(wěn)定,可用于梯度洗脫,聚合度分析范圍可至20以上;RID 主要受溫度、流量以及流動相的種類等因素的影響,洗脫系統(tǒng)較難穩(wěn)定,通常平衡時間較長。上述3種檢測器的采購和維護成本較高,一定程度上限制了殼寡糖產(chǎn)品的普遍性分析。

由于常規(guī)糖類化合物在紫外光波長范圍沒有吸收,即沒有吸光基團,常規(guī)紫外檢測器在糖類化合物分析中的應(yīng)用罕有報道。殼寡糖作為自然界中唯一帶正電荷的堿性寡糖,其雜環(huán)結(jié)構(gòu)中同時含有羥基和氨基,基于分子軌道理論,紫外照射會引起孤對n電子向單鍵σ電子發(fā)生能級躍遷,可以誘發(fā)殼寡糖在波長200 nm 附近產(chǎn)生一定吸收[15]。本工作基于紫外光可誘發(fā)殼寡糖電子能級躍遷的原理,在紫外檢測器波長200 nm 條件下,分析比較Shodex色譜柱(氨基修飾填料)和TOSOH 色譜柱(酰胺基修飾填料)對殼寡糖混合標準樣品的分離效果,并與RID條件進行比較,驗證紫外檢測器在殼寡糖分析檢測中的應(yīng)用可行性。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 infinity 型高效液相色譜儀,配RID、二極管陣列檢測器(DAD,本質(zhì)上也是一種紫外檢測器)和常規(guī)紫外檢測器;Wiggens UA22MFDN 型超聲波清洗器;Milli-Q 型超純水儀;ME 204型分析天平。

氨基葡萄糖標準溶液:5 g·L－1,稱取50 mg氨基葡萄糖,用水溶解并定容至10 mL 容量瓶中,配制成5 g·L－1的氨基葡萄糖標準溶液,保存于4 ℃冰箱。

殼寡糖混合標準溶液:30 g·L－1,稱取300 mg自制的殼寡糖混合標準樣品(DP 2～7),用水溶解并定容至10 mL,配制成30 g·L－1的殼寡糖混合標準溶液,保存于4 ℃冰箱。

氨基葡萄糖,純度98%;氨水為分析純;乙腈為色譜純;試驗用水為純水。

1.2 色譜條件

1)Shodex Asahipak NH2P-50 4E 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫30 ℃;進樣量10μL;流量1 mL·min－1;流動相為體積比7∶3的乙腈-1%(體積分數(shù))氨水的混合液;DAD 和RID雙檢測器,紫外檢測波長200 nm。

2)TOSOH TSK GEL Amide-80 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫80 ℃;進樣量10μL;流量1 mL·min－1;流動相為70%(體積分數(shù))乙腈溶液;DAD 和RID 雙檢測器,紫外檢測波長200 nm。

1.3 試驗原理

氨基葡萄糖是殼寡糖的單糖結(jié)構(gòu),與殼寡糖具有相同的官能團,使用氨基葡萄糖作為目標分子對單一聚合度殼寡糖的分析具有普適性[16],因此以氨基葡萄糖為參照。首先觀察氨基葡萄糖溶液的全波長掃描吸收情況,即波長190～400 nm 內(nèi)的吸收光譜,并比較兩種色譜柱條件下的分離效果;然后配制氨基葡萄糖的梯度濃度溶液,擬合在紫外檢測器(包括常規(guī)紫外檢測器及DAD,下同)特定波長條件下氨基葡萄糖的標準曲線;參照氨基葡萄糖的檢測方法,分析殼寡糖混合標準樣品在兩種檢測器條件下的分離效果與差異,并計算殼寡糖混合標準樣品的聚合度分布。

1.4 試驗方法

取1 mL氨基葡萄糖標準溶液或殼寡糖混合標準溶液,經(jīng)0.2μm 水系過濾膜過濾,在色譜條件下進樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 氨基葡萄糖的全波長掃描

移取1 mL氨基葡萄糖標準溶液,分別在兩種色譜條件下進樣分析,記錄在波長190～400 nm 內(nèi)的吸收光譜,吸收光譜圖見圖1,色譜分析結(jié)果見圖2。

圖1 氨基葡萄糖在波長190～400 nm 內(nèi)的吸收光譜Fig.1 Absorption spectra of glucosamine at the wavelength of 190－400 nm

圖2 兩種色譜條件下氨基葡萄糖的色譜圖Fig.2 Chromatograms of glucosamine under two chromatographic conditions

圖1為氨基葡萄糖色譜峰的全波長吸收情況,從圖1 中可以看出:吸收光譜發(fā)生在波長190～210 nm 處,且吸收強度逐漸降低;波長250 nm 處有較弱吸收光譜,推測可能是在氫鍵作用下,C－N轉(zhuǎn)向C＝N,并與羰基共軛產(chǎn)生較弱的π→π?躍遷吸收[17];波長300 nm 以上無吸收。據(jù)此可以判斷,紫外檢測器的吸收波長可以設(shè)定為190～210 nm內(nèi)的任意波長,考慮到美國藥典USP 28方法中氨基葡萄糖的檢測波長為195 nm[18],試驗又增加了波長200 nm 作為紫外檢測器設(shè)定波長,即分別以195 nm 和200 nm 作為紫外檢測波長,并用DAD代替常規(guī)紫外檢測器,開展多組分條件下的紫外吸收分析。

圖2 為氨基葡萄糖在TOSOH 色譜柱和Shodex色譜柱條件下的色譜圖。由圖2可見:同一色譜柱條件下,波長195,200 nm的吸收峰峰形無明顯差異;采用RID 檢測時,氨基葡萄糖在TOSOH 色譜柱和Shodex色譜柱條件下的保留時間分別為7.2,5.0 min,色譜峰占比分別為55.6%和83.5%(扣除負吸收);采用TOSOH 色譜柱時,在6.3 min出現(xiàn)“饅頭峰”,該疑似雜質(zhì)占比31.6%,但是僅從RID 信號分析,因溶劑吸收峰峰高過高,雜質(zhì)峰易被覆蓋或忽略,從而導(dǎo)致氨基葡萄糖樣品的檢測純度偏高;采用Shodex色譜柱時,氨基葡萄糖的保留時間較短,即與樹脂固定相的作用力弱于其在TOSOH 色譜柱的情況,且DAD 和RID 所得峰形接近,分離度優(yōu)于TOSOH 色譜柱,對于聚合度10以下的殼寡糖樣品,可以在更短時間內(nèi)完成分析檢測。因此試驗優(yōu)選Shodex色譜柱。

對比可知,在波長190～210 nm 內(nèi),紫外檢測器完全可以用作氨基葡萄糖的定性鑒定,本試驗在波長200 nm 處進行研究;而從純度和定量的角度考慮,Shodex色譜柱條件的純度檢測結(jié)果比較接近于現(xiàn)行行業(yè)標準方法,定量檢測亦可基于標準曲線進行計算。

2.2 氨基葡萄糖的標準曲線測定

將氨基葡萄糖標準溶液逐級稀釋,配制成0.5,1,2,4,5 g·L－1的氨基葡萄糖標準溶液系列,在Shodex色譜柱、紫外波長200 nm的色譜條件下進樣分析。以氨基葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標,其對應(yīng)的峰面積為縱坐標,擬合標準曲線。擬合得到的線性回歸方程為y＝753.6x＋13.18,線性范圍為0.5～5 g·L－1,相關(guān)系數(shù)為0.998 9,線性擬合結(jié)果符合檢測要求,可用于氨基葡萄糖的色譜分析的定量計算。

根據(jù)GB/T 5009.001－2003?食品衛(wèi)生檢驗方法-理化部分總則?對于方法檢出限的定義,將3倍空白值的標準偏差(s)相對應(yīng)的質(zhì)量或濃度作為檢出限,本方法的檢出限為儀器基線噪聲的3倍信號與標準曲線的斜率的比值,計算結(jié)果為0.011 g·L－1。

2.3 殼寡糖混合標準樣品的分離效果比較

移取1 mL 殼寡糖混合標準溶液,在Shodex色譜柱條件下進樣分析,結(jié)果見圖3。在波長195,200 nm 處檢測單一聚合度殼寡糖的吸收光譜,所得的吸收峰的保留時間和峰面積、殼寡糖的聚合度分布見表1。

圖3 Shodex色譜柱下的殼寡糖混合標準樣品的色譜圖Fig.3 Chromatogram of chitooligosaccharides mixed standard sample by Shodex chromatographic column

由圖3可知:在特定波長條件下,殼寡糖的紫外吸收峰與RID 信號基本一致,但基線有波動,在主要成分前后均檢測到較弱的吸收,殼七糖(DP 7)在RID信號中未顯示,而DAD條件下出現(xiàn)分離度較高的吸收尖峰,且此后仍有更高聚合度殼寡糖存在的可能。相比之下,RID 信號基線平穩(wěn),DP 2～6殼寡糖的相鄰組分完全分離。由表1可知:DP 3～6殼寡糖的占比較高,總占比達95.9%。因此,基于氨基葡萄糖的紫外吸收檢測同樣適用于殼寡糖成分的定性和定量檢測。

表1 殼寡糖混合標準樣品(DP 2～7)的保留時間和聚合度分布Tab.1 Retention time and DP distribution of chitooligosaccharides mixed standard sample(DP 2－7)

本工作基于氨基葡萄糖的電子能級躍遷光譜特性,利用常用的高效液相色譜紫外檢測器,在波長190～210 nm 內(nèi),實現(xiàn)了氨基葡萄糖和殼寡糖的定性、定量分析檢測,并對兩種市售色譜柱的氨基葡萄糖分析效果進行了比較。該方法具有操作簡單、靈敏度高和普適性強的特點,對于快速測定殼寡糖產(chǎn)品的聚合度分布和單一聚合度成分的含量起到有效補充,從而為科學(xué)合理制定殼寡糖產(chǎn)品的地方和國家標準提供理論和數(shù)據(jù)支撐。