徐泳嫻，鄒子鴻，湯菊芬，魯義善，簡紀(jì)常，蔡 佳,2**

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點實驗室，廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟動物病害控制重點實驗室，廣東湛江 524088；2.廣西科學(xué)院，廣西北部灣海洋研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學(xué)重點實驗室，廣西南寧 530007)

0 引言

斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)是我國南方主要的海水養(yǎng)殖魚類，但是近年來虹彩病毒病、神經(jīng)壞死病毒病、弧菌病頻發(fā)，對該品種的養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的危害[1]。目前，石斑魚的抗病免疫機理并不十分清楚，這不利于水產(chǎn)病害的防控及其藥物研發(fā)。以往的研究表明，病原的感染能誘導(dǎo)動物細(xì)胞產(chǎn)生大量非折疊蛋白，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而激活宿主的免疫反應(yīng)[2]。在這一過程中，蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶(Protein Disulfide Isomerase，PDI)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中高表達(dá)，通過硫醇依賴性的滯留(Thiol-Mediated Retention，TMR)來產(chǎn)生混合的二硫鍵，在ERP44蛋白介導(dǎo)下使蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)。ERP44是一類參與TMR過程的主要分子伴侶[3]，能與多種生物分子相互作用，例如免疫球蛋白M (IgM)、免疫球蛋白J鏈、免疫球蛋白K鏈[4]，白介素12 (IL-12)[5]，脂聯(lián)素(Adiponectin)[6]，甲?；a(chǎn)生酶/硫酸酯酶修飾因子1(FGE/Sumf1)[7]，Ero1α-β[8，9]，Ⅰ型肌醇1,4,5-三磷酸受體(Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors 1，IPR3R1)[10]，ER-高爾基中間體蛋白53 (ERGIC-53)[11]和硫氧還原蛋白4 (Peroxiredoxin 4，Prx4)[12]等。在ERP44的介導(dǎo)下，蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)揮停留、分子聚合、蛋白分泌或折疊[13]、鈣離子控制、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、維持氧化還原穩(wěn)態(tài)以及載體蛋白等作用[14-17]，進而引起細(xì)胞的免疫應(yīng)答。目前，已有學(xué)者報道不同宿主中ERP44的生理功能及其作用機理。Tian等[18]研究發(fā)現(xiàn)ERP44與鼻咽癌的進展有關(guān)，其能與ATP檸檬酸裂解酶發(fā)生相互作用，調(diào)控上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化來促進鼻咽癌細(xì)胞惡性表型的形成。Liyanage等[19]研究發(fā)現(xiàn)海馬ERP44基因在細(xì)菌、脂多糖刺激后表達(dá)上調(diào)，表明ERP44參與宿主的抗感染免疫。但是，其他魚類如石斑魚的ERP44是否具有類似的功能尚不清楚。

為了解ERP44基因在石斑魚抗感染免疫中的作用，本研究根據(jù)斜帶石斑魚轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)克隆了Ec-ERP44基因，進行生物信息學(xué)分析，并分析了Ec-ERP44在健康魚體中的組織分布及其在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)刺激后的表達(dá)變化，探討該基因及其介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控，以期為石斑魚的抗感染免疫機制研究及其病害防控策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

斜帶石斑魚購于廣東湛江市霞山水產(chǎn)品市場，并在實驗前兩周將其暫養(yǎng)于實驗室的循環(huán)系統(tǒng)中。實驗所用的石斑魚要求魚體表無損傷，正常攝食，活動性良好。脂多糖(LPS) 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；聚肌胞苷酸(Poly I:C)購自 Apexbio公司；TransZol Up Plus RNA Kit、實時熒光定量試劑盒(TransStart Green qPCR SuperMix)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PrimeSTAR HS DNA高保真聚合酶、大腸桿菌DH5α、pMD-18T 載體均購于Takara公司。本研究中所使用到的引物序列見表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物名稱、序列和用途

1.2 方法

1.2.1Ec-ERP44基因的克隆以及載體的構(gòu)建

依據(jù)從斜帶石斑魚轉(zhuǎn)錄文庫中[20]篩選獲得Ec-ERP44基因的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)序列設(shè)計特異性引物(表1)，并按照Primer STAR HS DNA高保真聚合酶說明書進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物通過瓊脂凝膠電泳檢測后進行純化，隨后與pMD-18T質(zhì)粒連接并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。培養(yǎng)12 h后挑取克隆子，并通過菌液PCR鑒定出陽性克隆，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.2 總RNA提取和cDNA模板的制備

利用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒從斜帶石斑魚中提取外周血淋巴細(xì)胞、脾臟、皮、肝臟、心、頭腎、肌肉、鰓和腦等9種組織的總RNA，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用 Bio.Analyzer 2100生物分析儀來檢測總RNA濃度，最后參照說明書進行反轉(zhuǎn)錄，獲得 cDNA模板，儲存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3Ec-ERP44的生物信息學(xué)分析

對Ec-ERP44基因進行生物信息分析，所使用的生物信息學(xué)分析工具及其用途見表2。

表2 Ec-ERP44基因的生物信息學(xué)分析工具及其用途

1.2.4 免疫刺激后斜帶石斑魚Ec-ERP44基因的表達(dá)特征分析

將采集的斜帶石斑魚隨機分為3組(30尾/組)，兩組為實驗組，一組為對照組。其中，兩個實驗組分別注射脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,10 μg/mL)和聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C,1 μg/mL)，注射劑量均為0.1 mL/尾；對照組注射等量PBS緩沖液。在注射后的0，4，8，12，24，48 h，分別從實驗組和對照組中隨機采集5尾魚的脾臟，提取總RNA，制備cDNA，存于-80℃冰箱備用。

將18S作為內(nèi)參基因(引物見表1)，并用引物Ec-ERP44-RT-F和Ec-ERP44-RT-R(表1)進行實時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μL，包含cDNA模板0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，雙蒸水3.5 μL，2×SYBR Green Mix (Roche) 5 μL。每個樣品設(shè)置5個復(fù)孔，反應(yīng)程序設(shè)為95℃，10 s；(95℃，5 s；58℃，15 s；72℃，20 s)×33次。實驗結(jié)果用2-ΔΔCT法計算，用SPSS 20進行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ec-ERP44的ORF序列分析

Ec-ERP44基因的ORF序列為1 233 bp(圖1)，編碼410個氨基酸。通過分析，預(yù)測Ec-ERP44分子質(zhì)量為46.84 kDa，等電點(Theoretical pI)為5.36，親水性平均系數(shù)為-0.364，預(yù)測其為親水性蛋白。

陰影部分指硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，ATG為起始密碼子，TGA* 為終止密碼子

2.2 ERP44蛋白的同源性以及進化樹分析

利用Clustal X軟件對斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)的Ec-ERP44和黃金鱸(Percaflavescens)、大黃魚(Larimichthyscrocea)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、斑馬擬麗魚(Maylandiazebra)、青鳉(Oryziaslatipes)、斑馬魚(Daniorerio)、熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、紅原雞(Gallusgallus)、人類(Homosapiens)等物種的ERP44進行氨基酸序列比對(圖2)，結(jié)果顯示斜帶石斑魚的Ec-ERP44氨基酸序列與上述物種的高度相似，推測Ec-ERP44基因可能具有協(xié)助蛋白折疊、轉(zhuǎn)運以及調(diào)控氧化還原反應(yīng)等生物學(xué)功能。

基于鄰元法(Neighbor-Joining,N-J)，利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建斜帶石斑魚Ec-ERP44的進化樹，結(jié)果如圖3。進化樹分為兩支，其中，斜帶石斑魚Ec-ERP44與魚類ERP44蛋白聚為一支，并與黃金鱸ERP44蛋白分類地位最接近。

圖3 基于N-J法構(gòu)建斜帶石斑魚Ec-ERP44系統(tǒng)進化樹

2.3 Ec-ERP44基因組織表達(dá)分析

使用熒光定量PCR檢測健康斜帶石斑魚的外周血淋巴細(xì)胞、脾臟、皮、肝臟、心、頭腎、肌肉、鰓和腦等組織中的Ec-ERP44基因表達(dá)量，結(jié)果如圖4。Ec-ERP44基因在所有檢測的組織中均有表達(dá)，其中，在腦中的表達(dá)量最高，接下來是鰓、頭腎、肌肉、心，在外周血淋巴組織中的表達(dá)量最低。

保守的半胱氨酸用箭頭標(biāo)出，保守的基序用虛線方框標(biāo)記

PBL:外周血淋巴細(xì)胞；Sp:脾；Sk:皮；L:肝臟；H:心；M:肌肉；HK:頭腎；G:鰓；B:腦

2.4 Ec-ERP44基因在LPS和Poly I:C刺激后的表達(dá)變化

由于魚類的脾臟是主要的免疫器官，其在魚類抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用，因此研究進一步檢測了免疫刺激后脾臟中Ec-ERP44基因的表達(dá)變化。如圖5所示，在LPS刺激后，脾臟中Ec-ERP44基因在刺激后的表達(dá)量顯著上調(diào)(P< 0.05)并在4 h達(dá)到峰值，隨后逐漸回復(fù)到0 h的表達(dá)水平；而在PolyI:C刺激后，脾臟中Ec-ERP44基因的表達(dá)量在4 h 時顯著上調(diào)(P< 0.05)，在12 h 時達(dá)到峰值，并在48 h時恢復(fù)到0 h的表達(dá)水平。

*P<0.05表示差異顯著

3 討論

在本課題組前期的研究工作中，已構(gòu)建了斜帶石斑魚轉(zhuǎn)錄組文庫[20]。本研究基于文庫中的ERP44基因序列設(shè)計引物，成功克隆了斜帶石斑魚的Ec-ERP44基因。生物信息學(xué)分析顯示Ec-ERP44基因的ORF編碼410個氨基酸，其所編碼的蛋白含有ERP44蛋白家族典型的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)與保守的CRFS催化基序，其中二硫鍵異構(gòu)酶PDI結(jié)構(gòu)域有助于維持ERP44蛋白的結(jié)構(gòu)，CRFS結(jié)構(gòu)域與該蛋白調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的功能息息相關(guān)[21]。而ERP44蛋白C端的RDEL保守基序則能幫助ERP44定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)[7]。此外，Ec-ERP44基因還含有硫醇硫氧還蛋白家族中高度保守的CXXC基序，該基序中的半胱氨酸在維持蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶的活性中發(fā)揮著重要的作用[22]。氨基酸序列比對表明,Ec-ERP44與其他物種的ERP44高度相似，因此可以推斷出Ec-ERP44與已經(jīng)報道的ERP44蛋白具有相似的生物學(xué)功能。

在健康石斑魚體內(nèi)，Ec-ERP44基因在腦和鰓的表達(dá)量較高，這與Liyanage等[19]的研究結(jié)果類似。Ec-ERP44基因在腦中的高表達(dá)可能是由于其所編碼蛋白能與葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(Glucose-regulated protein 78，GRP78)發(fā)生相互作用，從而調(diào)控Ⅰ型肌醇1,4,5-三磷酸受體(Inositol 1,4,5-trisphosphate receptors 1，IP3R1)介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑引起神經(jīng)細(xì)胞死亡[23]。鰓分泌粘液中含有的免疫球蛋白能阻止水體中病原的侵染[24]，且ERP44參與了免疫球蛋白單體轉(zhuǎn)化為多聚體的過程[25]，因此Ec-ERP44基因在鰓中的高表達(dá)可能與鰓中黏液分泌有關(guān)。在LPS以及Poly I:C的刺激后，石斑魚脾臟中Ec-ERP44基因表達(dá)上調(diào)，與海馬ERP44基因的研究結(jié)果[19]一致，表明該基因可能參加了宿主的抗病免疫。細(xì)胞在受到LPS以及Poly I:C刺激后產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進而能引起未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)，以激活下游的NF-κB轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，從而調(diào)控炎癥因子的表達(dá)。但是，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能就會受損；在肌醇需要酶1(IRE1)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)以及蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)信號的作用下，細(xì)胞啟動由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的凋亡途徑，從而導(dǎo)致機體發(fā)生病變[26]。因此，推測Ec-ERP44基因可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡與免疫因子的表達(dá)來影響魚體的抗感染免疫，這個假設(shè)將在下一步的研究中進行驗證。

4 結(jié)論

本研究對Ec-ERP44基因進行克隆與生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明Ec-ERP44蛋白含有二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)家族保守的硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域及特征性的半胱氨酸。Ec-ERP44基因在所有檢測組織中均有表達(dá)，其中在腦與鰓中的表達(dá)量較高，且在LPS和Poly I:C刺激后，脾臟中Ec-ERP44基因表達(dá)上調(diào)。本研究結(jié)果為進一步了解ERP44基因在免疫反應(yīng)中的作用奠定了基礎(chǔ)，同時也為探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑在魚類抗感染免疫中的作用提供了參考。