許愛祝，曾小飚，張翠嬌，唐健民，韋 霄,蒙美清，，梁敏玲,

(1.廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西桂林 541006； 2.桂林理工大學(xué)旅游與風(fēng)景園林學(xué)院，廣西桂林 541006；3.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西百色 533000)

0 引言

現(xiàn)代社會重金屬污染愈發(fā)嚴(yán)重，其來源主要有金屬冶煉及化工企業(yè)生產(chǎn)、污灌、固體廢棄物、農(nóng)藥及化學(xué)殘留等。銅(Cu)是動植物生長的微量必需元素，含量過高時會產(chǎn)生毒害作用，鎘(Cd)是比較常見且污染嚴(yán)重的一種重金屬，銅和鎘是重金屬污染中兩個主要的環(huán)境污染物，其中Cd污染較普遍，其次是Cu、Pb、Zn等。國內(nèi)許多地方從糧食、蔬菜中已檢測出含量超標(biāo)的重金屬有砷、鉛、鎘、銅等[1-3]。銅和鎘等重金屬的污染已經(jīng)成為影響我國農(nóng)業(yè)和生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展的重要因素。

過量的Cd容易被植物吸收并積累，影響農(nóng)作物產(chǎn)量[4，5]。Cd不僅影響植物細(xì)胞生長，而且會抑制葉綠素的合成，對植物光合作用產(chǎn)生復(fù)雜的影響。目前關(guān)于Cu對植物毒害的相關(guān)研究大都集中在對高等植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)和光合作用的影響等方面[6，7]?？偟膩碚f銅毒害作用和鎘毒害機(jī)理相似，兩者均對植物細(xì)胞生長發(fā)育、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、細(xì)胞器以及各種酶類產(chǎn)生廣泛的毒害作用，影響光合作用并對植物生長起抑制作用[8，9]。

目前，有關(guān)汞脅迫對玉米、小麥、水稻、辣椒等種子萌發(fā)和幼苗生長的影響研究較多，但有關(guān)于鎘、銅及其復(fù)合脅迫條件下麻瘋樹(JatrophacurcasLinn．)幼苗生理生化特性的研究報道較少。麻瘋樹也被稱為小桐子、木花生、老胖果、膏桐、黑皂樹等，屬大戟科(Euphorbiaceae Juss)麻瘋樹屬(Jatropha)，原產(chǎn)于巴西，適合生長在熱帶和亞熱帶地區(qū)，其中美洲和亞洲的熱帶地區(qū)占絕大多數(shù)。麻瘋樹是全球已發(fā)現(xiàn)并受到公認(rèn)的林業(yè)生物柴油物種，是當(dāng)今最有開發(fā)潛力和優(yōu)勢的樹種之一，得到國際組織、政府和企業(yè)的高度重視。經(jīng)廣西檢測中心測定，麻瘋樹種子含油率為53.6%；當(dāng)年種植，次年開花結(jié)果，5年進(jìn)入盛產(chǎn)期，正常結(jié)果期長達(dá)50年；具有較強(qiáng)的抗旱能力，適宜種植在貧瘠干熱地區(qū)，同時具有綠化作用和經(jīng)濟(jì)價值。

本研究以麻瘋樹種子為材料，研究受鎘、銅及其復(fù)合脅迫后，麻瘋樹幼苗葉片葉綠素a、葉綠素b、丙二醛(MDA)、可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量，以及過氧化物酶(POD)活性、根系活力、細(xì)胞膜透性、脯氨酸積累等生理生化特性，以揭示銅和鎘對麻瘋樹生理生化特性的影響和作用機(jī)制，為銅、鎘對麻瘋樹傷害機(jī)理的研究提供科學(xué)依據(jù)，并為麻瘋樹及其他受銅、鎘等重金屬元素危害的植物的保護(hù)和利用提供有效的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

麻瘋樹種子為云南壯大科技有限公司提供，編號為TB2。

儀器：電子天平、離心機(jī)、微量移液器、恒溫水浴鍋、可見光分光光度計、漩渦儀、DDS-307型數(shù)顯電導(dǎo)率儀、研缽、燒杯、容量瓶、量筒、移液管等。

試劑：標(biāo)準(zhǔn)脯氨酸溶液、酸性茚三酮、甲苯、脯氨酸、冰醋酸、磺基水楊酸、丙酮、乙酸乙酯、硫代硫酸鈉、碳酸鈣均為分析純級；1 mol/L硫酸、66 mmol/L磷酸緩沖液、10%三氯乙酸(TCA)、磷酸緩沖液、pH值為6.0的反應(yīng)混合液、1%氯化三苯四氮唑(TTC)等。

1.2 方法

1.2.1 種子催芽

用清水浸泡種子12 h，隨后用高錳酸鉀消毒液按照1∶5000的比例消毒10 min，將濕潤的棉花和兩層濾紙在培養(yǎng)皿中墊上一層，將實(shí)驗(yàn)種子平鋪在濾紙上，放入培養(yǎng)皿中恒溫培養(yǎng)，溫度為25℃，并且按時噴灑蒸餾水，確保種子所需水分。

1.2.2 盆栽沙培處理

(1)播種育苗

提前準(zhǔn)備好塑料杯作為栽培器具，器皿直徑為8 cm。將培育所需基質(zhì)定為珍珠巖，種子露白后，將種子進(jìn)行播種。每日用1/2的霍格蘭培養(yǎng)液體保持實(shí)驗(yàn)基質(zhì)的濕潤。

(2)脅迫處理

實(shí)驗(yàn)共設(shè)銅離子、鎘離子、銅和鎘復(fù)合離子3個因子，每個因子設(shè)6個處理，分別為6種不同的濃度，各處理濃度如表1所示，其中T1為對照組。每個處理包含10株長勢勻稱、體態(tài)一致的麻瘋樹幼苗，使用含有不同金屬濃度的培養(yǎng)液分別用于澆灑栽培基質(zhì)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行7 d后檢測各項生理指標(biāo)。

表1 不同試驗(yàn)因子及相關(guān)處理濃度

1.2.3 測定方法

以王小菁等[10]和張志良等[11]的實(shí)驗(yàn)研究為依據(jù)，無水丙酮提取并采用可見光光度法測定葉綠素含量；采用硫代巴比妥酸加熱顯色法測定丙二醛含量；采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性蛋白質(zhì)含量；使用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶的活性；使用TTC顯色法測定根系活力；通過測定外滲液電導(dǎo)率來測定植物細(xì)胞質(zhì)膜的透性；使用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)及繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗丙二醛含量的影響

丙二醛作為膜脂過氧化物的主要產(chǎn)物，能夠和核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸等活性物質(zhì)交換聯(lián)結(jié)，沉積為脂褐素(不溶化合物)，對細(xì)胞生命活動產(chǎn)生干擾，其膜脂過氧化程度通過內(nèi)部含量呈現(xiàn)[12,13]。丙二醛會抑制蛋白質(zhì)的合成，植物在衰老和逆境傷害的情況下，會發(fā)生膜脂過氧化生成丙二醛，通過丙二醛含量可了解植物組織的破壞程度。由圖1可知，Cd脅迫下丙二醛含量隨著Cd2+濃度的升高先升高后下降，當(dāng)濃度升高至10 mg/L時丙二醛含量降至最低，之后隨著Cd2+濃度的繼續(xù)增加丙二醛含量又再次升高，當(dāng)Cd2+濃度為100 mg/L時達(dá)到峰值，Cd2+濃度超過100 mg/L后丙二醛含量再次下降。Cu脅迫下，其濃度為100 mg/L時，麻瘋樹幼苗丙二醛含量最低，是對照組的82.92%；當(dāng)濃度增大至200 mg/L時，其MDA含量最高。在Cd、Cu復(fù)合脅迫下，當(dāng)Cu+Cd復(fù)合離子濃度為(25+5) mg/L時MDA含量最高，濃度加大至(100+50) mg/L時MDA含量降至最低。丙二醛含量低時對麻瘋樹幼苗生長有促進(jìn)作用；含量高時對麻瘋樹幼苗生長有毒害作用。

圖1 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗丙二醛含量的影響

2.2 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗根系活力的影響

根系為植物提供生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)，根系代謝強(qiáng)度與其活力有直接關(guān)系，活力高則代謝旺盛，對植株生長有好處。由圖2可知，Cd脅迫下麻瘋樹幼苗的根系活力先降低后升高，當(dāng)Cd2+濃度為100 mg/L時根系活力達(dá)到最高值，之后隨著濃度的繼續(xù)升高再次下降。但是可以看到，不管何種Cd2+濃度下的脅迫，根系活力都處在較高的水平，說明Cd2+脅迫對麻瘋樹根系活力影響不明顯。在Cu脅迫下，麻瘋樹幼苗根系活力隨著Cu2+濃度的增加先逐漸升高再迅速下降至幾乎接近零，表明根系基本死亡。Cu+Cd復(fù)合脅迫下，根系活力也是升高再降低，當(dāng)Cu+Cd復(fù)合濃度為(50+10) mg/L時，麻瘋樹幼苗根系活力最強(qiáng)，說明一定Cu+Cd復(fù)合離子濃度有利于幼苗的生長，而高濃度Cu+Cd復(fù)合離子則會毒害幼苗的生長。

圖2 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗根系活力的影響

2.3 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹葉綠素含量的影響

由圖3-5可知，隨著Cu2+濃度增加，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，Cu2+脅迫組麻瘋樹幼苗的葉綠素含量均比對照組的葉綠素含量有所增加，說明Cu2+濃度對麻瘋樹幼苗生長有促進(jìn)作用。Cu2+濃度為25 mg/L時，麻瘋樹幼苗葉綠素含量上升幅度較大，可能是麻瘋樹幼苗在Cu2+濃度為25 mg/L時表現(xiàn)出應(yīng)激作用，加快其光合作用(圖3)。Cd2+處理后的葉綠素含量相對于參照組的葉綠素含量普遍稍低，當(dāng)Cd2+濃度為5 mg/L時，葉綠素的含量降到最低；在50 mg/L及以上的Cd2+濃度時，葉綠素含量先降低后上升(圖4)，表明其濃度的增加不能說明對葉綠素積累有促進(jìn)或者抑制作用。在Cd、Cu復(fù)合脅迫下，其葉綠素總體呈小幅度起伏，說明Cd、Cu復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗光合作用的影響不大(圖5)。

圖3 不同銅離子濃度脅迫對麻瘋樹幼苗葉綠素含量的影響

圖4 不同鎘離子濃度脅迫對麻瘋樹幼苗葉綠素含量的影響

圖5 銅、鎘復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗葉綠素含量的影響

2.4 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗電導(dǎo)率的影響

Cu2+脅迫下，麻風(fēng)樹幼苗外滲液電導(dǎo)率隨Cu2+濃度增加而增加，呈顯著正相關(guān)關(guān)系(圖6)。Cd2+脅迫下，相對電導(dǎo)率總體是先升高再下降后上升的變化趨勢，濃度為10 mg/L時，其相對電導(dǎo)率為對照組的78.24%。Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度逐漸上升到(50+10) mg/L時，相對電導(dǎo)率緩慢下降。當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度為(100+50) mg/L時相對電導(dǎo)率急劇上升,當(dāng)復(fù)合濃度為(400+200) mg/L時相對電導(dǎo)率達(dá)到最高，為對照組的238.38%。

圖6 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗相對電導(dǎo)率的影響

2.5 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖7可知，麻瘋樹幼苗葉片中含有的可溶性蛋白質(zhì)含量隨Cd2+和Cu2+脅迫濃度升高而升高，Cd濃度為200 mg/L或Cu濃度為400 mg/L時，可溶性蛋白質(zhì)含量達(dá)到頂峰，分別為對照組的352.87%和575.06%。Cd、Cu復(fù)合脅迫時，可溶性蛋白質(zhì)含量也隨著處理濃度的增加而增加，但當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度分別為(25+5)、(50+10) mg/L時，可溶性蛋白質(zhì)含量與對照組差異不明顯;當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度分別達(dá)到(200+100)、(400+200) mg/L時，可溶性蛋白質(zhì)含量顯著提高，分別為對照組的190.87%和193.94%?？扇苄缘鞍踪|(zhì)作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，其增加可提高細(xì)胞的保水能力，同時對細(xì)胞的生命物質(zhì)、生物膜起保護(hù)作用。從圖7中可以明顯看出，Cd2+濃度為200 mg/L時可溶性蛋白質(zhì)含量變化最明顯，含量最高。

圖7 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

2.6 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗可溶性糖含量的影響

如圖8可示，單一金屬Cd處理下，麻瘋樹幼苗的可溶性糖含量先降低然后升高達(dá)到最大值(濃度為50 mg/L時)，但與對照組間的差異不明顯，說明Cd脅迫對麻風(fēng)樹可溶性糖含量影響不顯著。在Cu處理下，隨著其濃度增加，可溶性糖含量也隨之增加，當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到400 mg/L時，可溶性糖含量達(dá)到峰值，為對照組151.58%。復(fù)合脅迫時，麻瘋樹幼苗中可溶性糖含量隨脅迫濃度的升高而增加，當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度為(200+100) mg/L時，含量達(dá)到最高值，為對照組的143.52%?？扇苄蕴呛康脑黾樱軠p少重金屬脅迫對植物產(chǎn)生的傷害，增強(qiáng)植物的抗逆性。

圖8 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗可溶性糖含量的影響

2.7 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶是一種含鐵的酶，能促進(jìn)H2O2氧化酶類反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)植物的生長，在植物體的呼吸代謝中起著重要的作用。由圖9可知，單一Cu、Cd脅迫下，POD活性均隨Cu2+、Cd2+的濃度升高先緩慢上升后緩慢下降。當(dāng)Cu2+和Cd2+濃度分別為50，10 mg/L時，POD活性達(dá)到最高值，分別為對照組的116.14%和107.63%。當(dāng)Cu2+和Cd2+濃度分別為400，200 mg/L時，POD活性達(dá)到最小值，分別為對照組的96.38%和78.25%。表明Cu2+或Cd2+濃度較低時，能誘導(dǎo)過氧化物酶表達(dá)并消除脅迫下產(chǎn)生的活性氧。

圖9 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗過氧化物酶(POD)活性的影響

Cu+Cd復(fù)合脅迫對POD活性的影響不顯著，當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫處理濃度為(400+200) mg/L時，活性達(dá)到最大值，為對照組的1.027倍；當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度為(100+50) mg/L時，POD活性達(dá)到最小值，為對照組的0.956倍。

2.8 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗脯氨酸含量的影響

由圖10可知，隨著Cu2+濃度增加，麻瘋樹幼苗脯氨酸含量呈增大趨勢，低濃度(25，50 mg/L)處理對脯氨酸含量影響不顯著，高濃度(200，400 mg/L)處理能夠促進(jìn)麻瘋樹游離脯氨酸含量的顯著提高。同樣單一Cd脅迫時，當(dāng)濃度為200 mg/L時，脯氨酸含量增大；當(dāng)濃度為10 mg/L時，脯氨酸含量變少，為對照組的68.32%，說明10 mg/L的Cd2+阻礙了麻瘋樹幼苗體內(nèi)脯氨酸的合成。當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度達(dá)到(100+50)、(200+100)、(400+200) mg/L時，脯氨酸含量加速上升，分別為對照組的114.68%、165.66%、208.92%。復(fù)合脅迫時，麻瘋樹幼苗中脯氨酸含量隨著處理濃度的升高呈上升趨勢(圖10)，當(dāng)Cu+Cd復(fù)合脅迫濃度為(25+5) mg/L時，幼苗中的脯氨酸含量與對照組間差異不顯著，當(dāng)復(fù)合濃度大于等于(100+50) mg/L時，其含量與對照組間差距顯著。且隨復(fù)合脅迫濃度增加，脯氨酸含量高于單一金屬脅迫，說明復(fù)合脅迫增加了脯氨酸積累，加劇對細(xì)胞膜的破壞。

圖10 銅、鎘及其復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗脯氨酸含量的影響

3 討論

3.1 鎘脅迫對麻瘋樹幼苗生理生化特性的影響

重金屬對植物生理生化特征的影響會因?yàn)橥饨绛h(huán)境的變化而變化，重金屬污染嚴(yán)重會導(dǎo)致植物生長不良、產(chǎn)生病害，甚至早衰死亡。Cd對所有植物都具有毒性，Cd2+在低濃度(0.1-1.0 mg/kg)時抑制植物的生長、發(fā)育和繁殖，高濃度時可導(dǎo)致植物死亡[14]。本研究結(jié)果表明，Cd脅迫下麻瘋樹幼苗的MDA含量均較對照組增加，說明Cd2+在麻瘋樹幼苗體內(nèi)的積累可以破壞活性氧代謝平衡，同時隨著Cd2+濃度的增高，可溶性蛋白質(zhì)含量增加，且游離脯氨酸含量在5,100,200 mg/L時增加，使Cd2+對麻瘋樹幼苗的毒害作用減弱，從而使Cd2+對葉綠素的合成和根系活力的毒害作用降至最低，同時對植物細(xì)胞組織起到保護(hù)作用。當(dāng)Cd2+濃度> 50 mg/L時，實(shí)驗(yàn)顯示POD活性有明顯的下降趨勢，而可溶性糖和電導(dǎo)率明顯增高。以上結(jié)果表明，當(dāng)Cd2+濃度>50 mg/L時，Cd對麻瘋樹幼苗表現(xiàn)出毒害現(xiàn)象，這與徐玲玲等[15]、彭昌琴等[16]的試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 銅脅迫對麻瘋樹幼苗生理生化特性的影響

銅是植物生長的必需微量元素之一，也是葉綠素的重要組成部分，參與植物光合作用等，但Cu過量也會對植物產(chǎn)生毒害作用。本研究結(jié)果表明，在Cu脅迫下，濃度分別為25，100，50，400，400，400，50，200 mg/L時，相對應(yīng)的丙二醛、根系活力、葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、POD活性、脯氨酸含量等指標(biāo)相對于參照組均處于對植物組織具有積極利好階段。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，當(dāng)Cu2+濃度為100 mg/L時其MDA含量最低，當(dāng)濃度增大至200 mg/L時，其MDA含量最高。這是因?yàn)楦邼舛鹊腃u2+會破壞麻瘋樹幼苗葉片膜結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜透性增大和大量的MDA積累。麻瘋樹幼苗根系活力和過氧化物酶(POD)活性隨Cu2+濃度的增大先緩慢上升后緩慢下降。這是因?yàn)榈蜐舛鹊腃u2+不僅能誘導(dǎo)過氧化物酶活性，還能對其脅迫下產(chǎn)生的活性氧有一定的消除作用，從而使過氧化物酶(POD)的活性升高，但其維持系統(tǒng)穩(wěn)定的能力有限，當(dāng)脅迫達(dá)到一定強(qiáng)度時，這種能力會漸漸喪失，隨之酶的活性降低。酶活性的高低，在影響麻風(fēng)樹幼苗根系的生長的同時對其根系活力也有影響。而當(dāng)Cu2+濃度到達(dá)200 mg/L時，麻瘋樹根系活力值已經(jīng)很小，根系基本死亡。

麻瘋樹幼苗外滲液電導(dǎo)率、可溶性蛋白質(zhì)含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量都隨Cu2+濃度增加而增加，其中高濃度Cu (200，400 mg/L)能促進(jìn)麻瘋樹游離脯氨酸含量的顯著提高。當(dāng)Cu2+濃度到達(dá)一定程度后，可溶性糖和和可溶性蛋白質(zhì)的含量達(dá)到最大值，Cu2+濃度為400 mg/L時可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖含量均最大。

綜上所述，低濃度Cu2+不僅對麻瘋樹幼苗的毒害作用表現(xiàn)不明顯，還對相關(guān)生理指標(biāo)表現(xiàn)出促進(jìn)作用，符合低濃度Cu2+會促進(jìn)麻瘋樹幼苗生長這一科學(xué)理論，也表明當(dāng)Cu2+濃度達(dá)到一定程度時才會抑制、毒害麻瘋樹幼苗生長發(fā)育。

3.3 銅、鎘復(fù)合脅迫對麻瘋樹幼苗生理生化特性的影響

葉綠體是光合作用的主要場所，其結(jié)構(gòu)的完整性會影響植物光合作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著Cd+Cu復(fù)合脅迫濃度的提高，麻瘋樹幼苗葉片葉綠素雖有變化但是變化幅度不大，也就是說Cd+Cu復(fù)合脅迫不影響麻瘋樹幼苗葉片葉綠素的合成；但麻瘋樹幼苗POD活性有不同程度影響，即Cd+Cu復(fù)合脅迫致使幼苗體內(nèi)活性氧代謝失衡；麻瘋樹幼苗活性氧積累增多，導(dǎo)致膜脂過氧化，從而產(chǎn)生丙二醛等膜脂過氧化物。

本實(shí)驗(yàn)研究Cd2+、Cu2+復(fù)合脅迫時，當(dāng)Cd+Cu復(fù)合脅迫濃度為Cd2+<50 mg/L、Cu2+<100 mg/L時，麻風(fēng)樹幼苗中的脯氨酸含量與對照組沒有明顯變化；當(dāng)復(fù)合脅迫濃度中Cd2+達(dá)到100 mg/L及以上、Cu2+達(dá)到200 mg/L及以上時，其含量與對照組間差距顯著。脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可在逆境條件下大量合成，這就說明在高濃度復(fù)合脅迫逆境下，植物會為了保護(hù)自身的代謝功能而產(chǎn)生大量的脯氨酸。