林李泉，劉明珠，林國(guó)榮，黃帥帥，李夢(mèng)夢(mèng)，童桂香

(1.陽(yáng)西縣恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，廣東陽(yáng)江 529500；2.廣西壯族自治區(qū)漁業(yè)重大疫病防控與高效健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程研究中心，廣西南寧 530007；3.北部灣大學(xué)海洋學(xué)院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州 535011；4.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007；5.廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530021)

0 引言

黑鯛Acanthopagrusschlegelii，屬鱸形目Perciformes鯛科Sparidae棘鯛屬Acanthopagrus,是一種暖溫性底層海水經(jīng)濟(jì)魚類，廣泛分布于我國(guó)沿海各個(gè)地區(qū)、朝鮮半島、日本沿岸以及北太平洋西部。黑鯛生長(zhǎng)快，抗病力強(qiáng)，同時(shí)兼具廣鹽性、廣溫性及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，因此深受廣大養(yǎng)殖戶和消費(fèi)者的歡迎。鹽度是魚類生態(tài)系統(tǒng)最重要的環(huán)境因子之一，直接影響著魚類生長(zhǎng)發(fā)育[1，2]、繁殖[3]、生理和代謝活動(dòng)[4，5]。魚類為響應(yīng)鹽度變化而改變體內(nèi)生理代謝，從而進(jìn)化出復(fù)雜的滲透壓調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)適應(yīng)鹽度脅迫。目前有研究者指出鹽度對(duì)黑鯛的生長(zhǎng)[6，7]、生理生化[8]和營(yíng)養(yǎng)成分[9]等有一定的影響；此外，調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀鸵葝u素生長(zhǎng)因子I[10]、催乳激素及其受體[11，12]、抗氧化[13]、水通道蛋白和精氨酸催產(chǎn)素受體[14]等功能基因?qū)邗犨m應(yīng)鹽度脅迫有著重要的調(diào)節(jié)作用。Na+-K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NKCC1)屬于SLC12基因家族的陽(yáng)離子氯化物協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)跨膜蛋白，能夠介導(dǎo)Na+、K+和Cl-這3種離子以電中性方式協(xié)同穿過(guò)動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜[15]。在急性鹽度脅迫下，卵形鯧鲹NKCC1基因?qū)}度變化響應(yīng)迅速，當(dāng)轉(zhuǎn)入淡水時(shí)，NKCC1基因在鰓和腎中的mRNA水平降低，而在腸中的表達(dá)相反[16]。在高滲鹽度脅迫下，NKCC1基因的表達(dá)量在歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)[17]、底鳉(Fundulusheteroclitus)[18]和莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambicus)[19]鰓組織中顯著升高。此外，在卵形鯧鲹的鰓、腎和腸中，NKCC1基因的mRNA水平也顯著增加。而轉(zhuǎn)入淡水后，底鳉NKCC1基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量顯著降低[18]。因此，NKCC1基因在滲透壓調(diào)節(jié)方面起到關(guān)鍵的作用。

目前尚未見有關(guān)黑鯛NKCC1基因在急性鹽度脅迫中的相關(guān)報(bào)道。為探究黑鯛NKCC1基因在急性鹽度脅迫中的表達(dá)特征，本研究克隆黑鯛NKCC1基因序列，分析其氨基酸同源性、進(jìn)化關(guān)系及其在不同組織中的表達(dá)方式，闡明NKCC1基因在不同鹽度下的mRNA表達(dá)特征，以期為解析黑鯛的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為黑鯛養(yǎng)殖的最適鹽度范圍提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

從陽(yáng)西縣恒生水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社購(gòu)置500尾黑鯛幼魚，體質(zhì)量約為(30.1±3.2) g/尾，并置于300 L海水循環(huán)養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)一周，溫度為(23.1±1.3)℃，溶氧量為6.5-7.0 mg/L。

試驗(yàn)所用TRIzol Reagent購(gòu)自Invitrogen公司，2×Taq PCR Mastermix、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物有限公司，SYBR Green，RT反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司、大腸桿菌感受態(tài)DH5α購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

暫養(yǎng)期間，隨機(jī)挑選3尾魚，采集其肝、脾、腎、心、腦、眼、鰓、腸、鰭條、皮膚、性腺和白肌等12個(gè)組織，液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

在鹽度脅迫實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置5，25，35共3個(gè)鹽度實(shí)驗(yàn)組，每組50尾樣品。黑鯛是河口性魚類，在鹽度15時(shí)生長(zhǎng)速度較快，因此設(shè)置鹽度15為對(duì)照組。將暫養(yǎng)的魚隨機(jī)轉(zhuǎn)移到各組中，分別于第0，4，8，12，24，48，72 h隨機(jī)在每組挑選3尾魚采集鰓組織，使用液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

以黑鯛基因組中NKCC1基因的cDNA序列為模板，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)NKCC1基因的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)擴(kuò)增引物和熒光定量PCR引物，以黑鯛18S RNA基因作為內(nèi)參基因(表1)。實(shí)驗(yàn)所有引物合成及測(cè)序均委托北京擎科生物有限公司完成。

表1 實(shí)驗(yàn)所需引物

1.4 黑鯛NKCC1基因全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)TRIzol Reagent試劑盒說(shuō)明書提取黑鯛組織總RNA。利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的質(zhì)量和濃度。根據(jù) PrimeScript RT Master Mix 將提取的總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。根據(jù)2×Taq PCR Master Mix試劑盒，以提取的cDNA為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)總體系為25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。利用PCR產(chǎn)物試劑盒進(jìn)行產(chǎn)物純化回收，將片段連接至pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，搖菌3 h后，接入帶氨芐抗性的LB平板中，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR陽(yáng)性檢測(cè)。陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果送至北京擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI ORF Finder在線工具(https：//www.ncbi.nlm.nib.gov/orffinder)和基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://asia.ensembl.org/info/about/species.html)驗(yàn)證預(yù)測(cè)黑鯛NKCC1基因的開放閱讀框(Open reading frame,ORF)。利用ProParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)和NetNGlyc1.0(https://services.healthtech.dtu.dk/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。使用NCBI Protein BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nib.gov/Blast.cgi)對(duì)黑鯛NKCC1進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。利用DNAMAN6.0和MEGA5.0軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比較和進(jìn)化樹構(gòu)建。

1.6 黑鯛NKCC1基因組織表達(dá)分析

使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-PCR)實(shí)驗(yàn)。樣品的cDNA模板稀釋至100 ng/μL，PCR反應(yīng)總體系為12.5 μL，包括1 μL模板，6.5 μL SYBR Premix，上下游引物各0.5 μL，4 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 30 s；95℃ 15 s，55℃ 15 s，68℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用△△CT 法(2-△△CT)進(jìn)行分析；數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 19進(jìn)行單因素方差分析(AMOVA)，并進(jìn)行Duncan's多重比較分析各組間差異的顯著性，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑鯛NKCC1基因克隆及序列分析

黑鯛NKCC1基因ORF全長(zhǎng)為3 504 bp，共編碼1 167個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為127.19 kDa，理論等電點(diǎn)為5.75。利用NitNlyc1.0 預(yù)測(cè)顯示黑鯛NKCC1為跨膜蛋白。利用MEGA5.0 對(duì)黑鯛NKCC1氨基酸序列分析，結(jié)果表明在51-1 167氨基酸殘基間有一個(gè)典型的Na+-K+-Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC12A結(jié)構(gòu)域，在不同物種中具有很高的保守性(圖1)。

圖1 黑鯛NKCC1的氨基酸序列對(duì)比和結(jié)構(gòu)域分析

2.2 同源性分析及進(jìn)化樹

黑鯛NKCC1氨基酸序列與其他物種的NKCC1同源性為66.1%-97.8%(表2)。其中，與金頭鯛的同源性最高，為97.8%；與斑馬魚的同源性最低，為 66.1%。此外，與大黃魚、鞍帶石斑魚和尖吻鱸的同源性均大于90%。

表2 黑鯛NKCC1氨基酸與其他物種的同源性

續(xù)表2

從系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出黑鯛NKCC1首先與金頭鯛NKCC1a聚為一支(圖2)，然后再與大黃魚、鞍帶石斑魚、尖吻鱸NKCC1聚為一支，再與斑馬魚和斑點(diǎn)雀鱔NKCC聚為一支，而羅非魚、金頭鯛、歐洲鱸的NKCC1b則單獨(dú)聚為一支。此外，小鼠、雞和人等外源物種的NKCC1聚為一支。

圖2 黑鯛NKCC1基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.3 黑鯛NKCC1基因不同組織表達(dá)分析

黑鯛NKCC1基因在所檢測(cè)的12個(gè)組織，即肝臟、腎臟、心、腦、眼、鰓、鰭條、脾臟、皮膚、腸、性腺和白肌中均有表達(dá)量(圖3)。其中，在腎臟、鰓和腸中表達(dá)量較高，顯著高于其他組織(P<0.05)；其次為肝臟、腦、脾臟、皮膚、性腺和白肌，表達(dá)量最低的組織為心、眼、鰭條，顯著低于其他組織(P<0.05)。

不同字母表示兩組間具有顯著性差異(P<0.05)

2.4 不同鹽度脅迫條件下黑鯛NKCC1基因的表達(dá)分析

不同鹽度脅迫下NKCC1基因在黑鯛鰓和腎臟組織中的相對(duì)表達(dá)量如圖4所示。在鰓組織中(圖4a)，在對(duì)照組(鹽度15組)中，NKCC1基因在12 h后顯著上升，在24 h后達(dá)到頂峰，隨后開始逐漸下降；在鹽度5組中，NKCC1基因在處理4 h后就顯著上調(diào)，且其表達(dá)量在第4，8，12和24 h均顯著高于對(duì)照組，而在72 h則顯著低于對(duì)照組；在鹽度25組中，NKCC1基因表達(dá)量隨著時(shí)間推移而緩慢上升，至24 h達(dá)到頂峰，在24，48和72 h時(shí)的表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組；在鹽度35組中，其表達(dá)變化與鹽度25組類似。

在腎臟組織中(圖4b)，在對(duì)照組(鹽度15組)中，NKCC1基因表達(dá)量隨著時(shí)間推移而明顯升高，至24 h后達(dá)到頂峰(相比于0 h提高6.6倍)，隨后慢慢下降，至72 h仍高于0 h；在鹽度5組中，NKCC1基因的表達(dá)量隨著時(shí)間推移而緩慢升高，至24 h達(dá)到頂峰，隨后開始慢慢下降，至72 h后逐漸恢復(fù)到開始時(shí)的水平；在鹽度25組中，NKCC1基因在第8 h開始出現(xiàn)明顯上調(diào)(P<0.5)，至24 h到達(dá)頂峰，隨后開始下降；在鹽度35組中，NKCC1基因表達(dá)量緩慢升高，至8 h到達(dá)頂峰，隨后開始下降。

不同字母表示兩組間具有顯著性差異(P<0.05)

在鰓組織中(圖4a)，在低鹽度脅迫下，NKCC1基因的表達(dá)量對(duì)鹽度變化反應(yīng)十分迅速，在處理4 h后就會(huì)顯著刺激NKCC1基因的表達(dá)量，且一直持續(xù)至48 h；而在高鹽度脅迫下，NKCC1的表達(dá)量對(duì)鹽度變化的響應(yīng)在早期并不明顯，至24 h后會(huì)出現(xiàn)顯著抑制現(xiàn)象，一直持續(xù)至72 h。在腎臟組織中(圖4b)，低鹽度和高鹽度脅迫下，NKCC1基因的表達(dá)量均會(huì)隨著時(shí)間推移而出現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象。此外，相比于對(duì)照組，低鹽度和高鹽度脅迫在都會(huì)在不同時(shí)間點(diǎn)抑制NKCC1基因的表達(dá)量。上述實(shí)驗(yàn)表明,NKCC1基因在維持黑鯛滲透壓和離子平衡過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。

3 討論

NKCC是一類電中性跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是溶質(zhì)載體家族的成員之一，可以按Na+∶K+∶Cl-=1∶1∶2的比例進(jìn)行離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[20,21]，從而參與調(diào)節(jié)極化細(xì)胞中的離子和水分運(yùn)動(dòng)。在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中都發(fā)現(xiàn)有NKCC，其在維持細(xì)胞體積的穩(wěn)態(tài)和電解質(zhì)含量的過(guò)程中起關(guān)鍵作用[22]。在不同滲透壓環(huán)境中，魚類的NKCC會(huì)被激活，向體外分泌離子，從而維持滲透壓平衡。在低鹽度情況下，魚類體內(nèi) Na+、Cl-濃度低于外界環(huán)境；在高鹽度情況下，魚類體內(nèi)的 Na+、Cl-濃度高于外界，此時(shí)機(jī)體激活細(xì)胞膜上的NKCC蛋白，通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸調(diào)節(jié)離子濃度，使機(jī)體內(nèi)外的滲透壓達(dá)到平衡[20，21]。

許多研究報(bào)道NKCC蛋白參與魚類滲透壓的調(diào)節(jié)，例如在舩魚(Fundulusheteroclitus)中，當(dāng)進(jìn)行淡水轉(zhuǎn)移后，其NKCC1a表達(dá)量在每個(gè)組織中均被抑制;而從微咸水轉(zhuǎn)移至海水后，NKCC1amRNA的表達(dá)增加[23]。在羅非魚(Sarotherodonmelanothern)中，不同鹽度環(huán)境會(huì)顯著影響鰓組織中NKCC1amRNA的表達(dá)水平，在136‰鹽度海水中其表達(dá)量會(huì)比在淡水中高4.9倍[24]。已有學(xué)者研究黑鯛在鹽度脅迫下，為適應(yīng)環(huán)境所起重要調(diào)節(jié)作用的相關(guān)基因[10-14]，但尚未見有關(guān)于黑鯛NKCC1基因參與滲透壓調(diào)節(jié)的相關(guān)報(bào)道。在本研究中，通過(guò)克隆獲得黑鯛NKCC1基因，該基因cDNA的ORF全長(zhǎng)為3 504 bp，編碼1 167個(gè)氨基酸，理論蛋白分子量為127.19 kDa，理論等電點(diǎn)為5.75。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示在51-1 167氨基酸殘基間有一個(gè)典型的Na+-K+-Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC12A結(jié)構(gòu)域，這與斑馬魚、金鯧、羅非魚等物種的SLC12A結(jié)構(gòu)域具有高度一致性，表明SLC12A結(jié)構(gòu)域在不同物種中具有很高的保守性，同時(shí)也表明黑鯛NKCC1與其他物種的NKCC1一樣，具有潛在的Na+-K+-Cl-離子共同轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

組織表達(dá)分析表明NKCC1基因在黑鯛各組織中均有表達(dá)，且在腎臟、鰓和腸中表達(dá)量最高。在其他硬骨魚類如舌齒鱸、羅非魚和大西洋鮭的組織中，均發(fā)現(xiàn)有NKCC1基因的表達(dá)[25-27]，而本研究的結(jié)果與其他魚類中的研究類似。此外，腎臟、鰓和腸均為參與魚類滲透壓調(diào)節(jié)的重要組織，黑鯛NKCC1基因在上述組織中具有顯著高于其他組織的表達(dá)量，暗示該基因在滲透壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能。

對(duì)不同鹽度脅迫下NKCC1基因在鰓和腎臟中的時(shí)間表達(dá)特征分析表明，與腎臟組織相比，NKCC1基因在鰓組織中的滲透壓調(diào)節(jié)作用更明顯，且在低鹽度脅迫下反應(yīng)十分迅速。這一結(jié)果與大西洋鮭和攀鱸(Anabasteseuclineus)中的結(jié)果相似[28]，說(shuō)明黑鯛NKCC1基因主要發(fā)揮作用的器官是鰓組織。另外，相較于高鹽度脅迫，黑鯛NKCC1基因?qū)Φ望}度脅迫的響應(yīng)更為明顯迅速。

魚類在海水中通過(guò)吞飲吸收水分，再通過(guò)腸道攝取，進(jìn)而用鰓排泄。當(dāng)轉(zhuǎn)移至淡水環(huán)境中時(shí)，由于吞咽水的反射和水分?jǐn)U散，魚機(jī)體增加了腸內(nèi)的水量。為停止反射、促進(jìn)水分泌，魚機(jī)體會(huì)提高NKCC1基因的表達(dá)，促進(jìn)離子進(jìn)入細(xì)胞以增加細(xì)胞液濃度。盡管黑鯛滲透調(diào)節(jié)能力較強(qiáng)，但仍不能在急性條件下適應(yīng)淡水，因此也會(huì)激活NKCC1基因表達(dá)以適應(yīng)低鹽度環(huán)境。有學(xué)者認(rèn)為NKCC1基因的快速響應(yīng)受磷酸化和去磷酸化調(diào)節(jié)的影響，而觸發(fā)NKCC1基因磷酸化的信號(hào)似乎是細(xì)胞內(nèi)Cl-本身[29]。因此，推測(cè)在低鹽度脅迫條件下，黑鯛鰓組織中的NKCC1基因的磷酸化因細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的降低而激活，繼而提高NKCC1基因的表達(dá)量，增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的離子量，從而促進(jìn)水分泌，以維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。綜上所述，本研究可為解析黑鯛NKCC1基因參與滲透壓調(diào)節(jié)的功能機(jī)制和建立黑鯛最適鹽度養(yǎng)殖模式提供了一定的技術(shù)理論，并為研究魚類滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究分析黑鯛NKCC1基因的分子特征及其在不同鹽度脅迫環(huán)境下的表達(dá)特征，得出以下結(jié)論：(1)黑鯛NKCC1基因ORF全長(zhǎng)為3 504 bp，共編碼1 167個(gè)氨基酸，為跨膜蛋白，定位在細(xì)胞膜上，且含有一個(gè)典型的Na+-K+-Cl-共同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC12A結(jié)構(gòu)域;(2)NKCC1基因在黑鯛的滲透壓調(diào)節(jié)組織中均有表達(dá)，其中，在腎臟、鰓和腸3個(gè)組織中的表達(dá)量顯著高于其他組織(P<0.05);(3)與腎臟組織相比，NKCC1基因在鰓組織中發(fā)揮的滲透壓調(diào)節(jié)作用更為明顯，且在低鹽度脅迫時(shí)發(fā)揮的作用更為迅速，推測(cè)是由于低鹽度脅迫，黑鯛鰓組織NKCC1基因的磷酸化因細(xì)胞內(nèi)Cl-濃度的降低而被激活，繼而提高NKCC1基因的表達(dá)量，增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的離子量，從而促進(jìn)水分泌，以維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。本研究成果有助于揭示黑鯛NKCC1參與滲透壓調(diào)節(jié)的功能機(jī)制，并為魚類滲透壓調(diào)節(jié)研究提供一定的理論基礎(chǔ)。