李 樂，刁 菁，于曉清，王曉璐，王友紅，葉海斌，吳海一

(山東省海洋科學研究院，山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室，山東青島 266104)

0 引言

殺鮭氣單胞菌是魚類養(yǎng)殖過程中危害比較嚴重的一種細菌性病原，包括殺鮭亞種Aeromonassalmonicidasubsp.salmonicida、無色亞種A.salmonicidasubsp.achromogenes、殺日本鮭亞種A.salmonicidasubsp.masoucida(ASM)、史氏亞種A.salmonicidasubsp.smithia和溶果膠亞種A.salmonicidasubsp.pectinolytica[1]，其中殺鮭亞種能引起冷水魚的“癤瘡病”，發(fā)病率和死亡率高，其他亞種致病力相對較弱，但是具有更廣泛的宿主范圍，能感染鯉魚、河鱸、六線魚、大菱鲆、大西洋鱈、裸蓋魚等多種重要養(yǎng)殖魚類[2,3]，并且可與其他氣單胞菌屬混合感染，對我國魚類養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失，并對我國冷水魚類養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展造成重大的潛在威脅，因此有關該病的防治技術研究亟待開展。在養(yǎng)殖魚類病害防控方面，以疫苗免疫技術為基礎的綜合防控技術體系是目前被國際上認可、接受并積極推廣的病害防治技術[4]，挪威、美國等發(fā)達國家均有商品化的殺鮭氣單胞菌疫苗，該疫苗的使用大大降低了抗生素的使用，并有效控制疾病的發(fā)生[5]。目前，我國殺鮭氣單胞菌疫苗的研制大多仍處于實驗室研究階段，而且主要以福爾馬林滅活的滅活疫苗為主[6]，雖然能使魚體獲得一定的免疫保護力，但在安全性方面存在一定的隱患，隨著對該菌病原特性和致病機理的深入研究以及蛋白體外重組表達技術的成熟，研發(fā)安全高效的亞單位疫苗也越來越受到重視和推進。

生物信息學技術的不斷發(fā)展，使基于反向疫苗學開發(fā)殺鮭氣單胞菌基因工程亞單位疫苗具備了理論基礎和技術手段[7]，迄今已有多株殺鮭氣單胞菌的全基因組被系統(tǒng)解析，并對其重要的毒力相關基因與蛋白進行了生物信息學預測[8-10]，通過對重要候選靶標蛋白進行原核重組表達和免疫保護性試驗,篩選到多個具有較高免疫保護率的亞單位候選蛋白，其中溶血素型鈣結(jié)合區(qū)蛋白表現(xiàn)出較高的潛在開發(fā)價值[11]。本課題組前期也針對多個殺鮭氣單胞菌外膜蛋白研究篩選具有免疫保護效果的亞單位候選蛋白，結(jié)果顯示重組外膜蛋白C可以有效誘導魚體產(chǎn)生特異免疫應答，并提供最佳的免疫保護效果[12]。因而，基于反向疫苗學研究篩選殺鮭氣單胞菌亞單位疫苗切實可行。

溶血素(Hemolysin)是一類具有溶血活性的蛋白質(zhì)，是氣單胞菌重要的毒力因子，而菌毛(Pilin)在細菌的侵染和定植過程中也發(fā)揮重要作用。因此，本研究擬利用體外重組表達技術，對殺鮭氣單胞菌兩個潛在毒力相關蛋白溶血素和菌毛蛋白進行重組表達，以虹鱒為研究對象檢測其免疫保護效果，并分析其對虹鱒免疫應答的誘導作用，以期為魚類細菌亞單位疫苗的研究提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及試驗動物

致病性殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種Aeromonassalmonicidasubsp.masoucida由山東省海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室從患病虹鱒中分離保存[13]；健康虹鱒購自濰坊某養(yǎng)殖場，體長(13±2) cm，體質(zhì)量為(60±5)g，實驗前循環(huán)水暫養(yǎng)15 d，養(yǎng)殖水溫為(17±1)℃。

1.1.2 試劑和耗材

重組表達試劑盒pDE2 Directional Expression Kit Ver.2購自北京擎科生物科技有限公司；DNA提取試劑盒MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、RNA提取試劑盒MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、反轉(zhuǎn)錄試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit、cDNA合成試劑盒High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit及熒光定量PCR試劑SYBR? Premix Ex Taq Mix均購于TaKaRa公司；堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG和PVDF膜購自德國Merk Millipore；虹鱒抗滅活A.salmonicida血清由本實驗室制備；鼠抗虹鱒IgM單克隆抗體購自Aquatic Diagnostics；異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷購自南京建成生物工程研究所；SDS-PAGE等其它試劑購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶血素和菌毛蛋白的原核重組表達與純化

采用試劑盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit方法提取殺鮭氣單胞菌總DNA，以此為模板，依據(jù)Genbank庫中殺鮭氣單胞菌溶血素及菌毛的基因序列，設計特異性擴增引物(表1)，對目的基因擴增并進行測序。序列驗證無誤后將2種蛋白基因擴增產(chǎn)物切膠回收進行純化，利用pDE2 Directional Expression Kit分別構(gòu)建pET28-hly及pET28-Pln表達載體，并將表達載體轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞(DH5α)，于不含卡納霉素的LB液體培養(yǎng)基中復蘇并轉(zhuǎn)接于LB平板培養(yǎng)，挑取單菌落進行T7和T7ter雙向測序比對序列，將序列正確的重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.coli細胞(BL21，DE3)，涂布含卡那霉素的平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進行菌落PCR并對陽性菌落進行測序確認。將經(jīng)測序鑒定正確的陽性菌用異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進行誘導表達，以Ni2+親和層析柱(GE)分別純化重組溶血素和重組菌毛蛋白，將純化蛋白以0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH值為7.2)重懸并以Bradford法測定蛋白濃度，將濃度調(diào)整至1 mg/mL凍存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，利用SDS-PAGE分析蛋白重組表達及純化結(jié)果。

表1 溶血素及菌毛蛋白基因擴增引物信息

1.2.2 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫原性測定

利用Western-blotting分析重組蛋白的免疫原性。將上述純化后的重組溶血素和重組菌毛蛋白進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，然后浸泡于含4%牛血清白蛋白的PBS溶液中，4℃封閉過夜，用PBST(含0.05%Tween-20的PBS溶液)洗滌3次后，分別用虹鱒抗滅活ASM血清和健康虹鱒血清(1∶50)于37℃孵育1 h，洗滌后加入鼠抗虹鱒IgM單克隆抗體(1∶50)于37℃孵育1 h，洗滌后加入堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG (1∶5 000)于37℃孵育1 h，最后將PVDF膜置于NBT-BCIP發(fā)色液中發(fā)色，以去離子水洗滌終止反應，觀察并拍照。

1.2.3 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫保護效果測定

將健康虹鱒隨機分為5組，每組30尾魚，用上述純化后的重組溶血素、重組菌毛蛋白及兩者1∶1(W∶W)混合物、甲醛滅活的殺鮭氣單胞菌全菌分別與弗氏完全佐劑1∶1(V∶V)混合后，免疫健康虹鱒，以注射PBS和佐劑混懸液作為陰性對照，每尾腹腔注射100 μL。免疫6周后，依據(jù)前期毒力實驗結(jié)果[13]，選擇濃度為5×107CFU/mL殺鮭氣單胞菌進行攻毒，每尾腹腔注射100 μL，連續(xù)觀察21 d并記錄攻毒后魚體的死亡情況，計算免疫組的相對免疫保護率(Relative Percentage Survival,RPS)。

1.2.4 虹鱒對重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫應答特性

1.2.4.1 免疫、攻毒及取樣

將健康虹鱒隨機分為4組，每組20尾魚，分別用上述純化后的重組溶血素、重組菌毛蛋白及兩者1∶1 (W∶W)混合物、PBS與弗氏完全佐劑等體積混合后，免疫健康虹鱒。在免疫后2，4，6周，每組每個時間點取3尾魚制備抗血清用于特異性抗體水平檢測，血清的取樣方式為尾靜脈取血，室溫放置2 h后，轉(zhuǎn)入4℃過夜，次日于4℃下3 000 g離心15 min，取上清-20℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r，在免疫后6周用殺鮭氣單胞菌對虹鱒進行攻毒，方法同1.2.3節(jié)。攻毒后24 h，每組取樣6尾魚，用無菌剪刀剪下脾臟并切成0.5 cm小塊置于RNA later中-80℃保存，用于免疫相關基因表達特性研究。

1.2.4.2 ELISA檢測虹鱒外周血特異性抗體水平變化

分別將重組溶血素和重組菌毛蛋白包被于96孔酶標板中，每孔50 μg，4℃靜置過夜，次日用含4%牛血清白蛋白的PBS溶液于37℃封閉1 h，PBST洗滌3次后，分別加入100 μL免疫后不同時間點收集的虹鱒血清(1∶100)，37℃孵育1 h，每個樣品設置3個重復，洗滌后依次加入100 μL鼠抗虹鱒IgM單克隆抗體(1∶50)和100 μL堿性磷酸酶標記的羊抗鼠IgG (1∶5 000)，孵育條件均為37℃，1 h，最后加入100 μL pNPP底物發(fā)色液室溫避光發(fā)色30 min，每孔加入50 μL 2 mol/L NaOH終止反應，置于酶標儀(Tecan) 405 nm處讀取OD值。以PBS免疫組血清作為陰性對照，吸光值P/N>2時的待測血清最大稀釋度作為各時間點血清樣品的效價。

1.2.4.3 熒光定量PCR檢測虹鱒脾臟免疫相關基因表達情況

利用熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測各免疫組虹鱒在殺鮭氣單胞菌攻毒后24 h，脾臟中9種免疫相關基因表達情況。9種免疫相關基因白介素1β (IL-1β)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)、干擾素(TNFα)、主要組織相容復合物Ⅱα(MHC-Ⅱα)、免疫球蛋白M重鏈(IgM)、T淋巴細胞受體α鏈(TCRα)、T細胞CD4分子和CD8分子以及內(nèi)參基因18S rRNA的引物信息如表2所示。利用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，提取虹鱒脾臟組織的總RNA，以High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit參照說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，qPCR反應體系為SYBR? Premix Ex Taq Mix，反應在CFX96TM實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio rad，USA)中進行，以各免疫組攻毒前脾臟樣品作為參照，按照2-ΔΔCt法分析各基因在攻毒后24 h的相對表達情況。

表2 熒光定量PCR所用引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

運用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析(Version 20.0，IBM)，通過單因素方差分析(ANOVA)分析差異性，實驗結(jié)果以平均數(shù)±標準誤(Mean±SEM)表示，在所有情形中，若P<0.05，則認為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶血素和菌毛蛋白的原核重組表達與純化結(jié)果

將擴增獲得的A.salmonicida溶血素和菌毛蛋白基因分別插入表達載體pET28，構(gòu)建了pET28-hly及pET28-Pln表達載體，通過轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，最終篩選獲得表達工程菌各4株，通過IPTG誘導表達，最終獲得分子量分別為70,10 kDa的目的蛋白，與理論分子量大小相符。經(jīng)鎳離子親和層析柱純化后，獲得了高純度的重組溶血素和重組菌毛蛋白(圖1，泳道1，2)，可用于后續(xù)免疫。

2.2 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫原性分析

為了驗證2種重組蛋白的免疫原性，利用Western-blotting實驗分析了重組溶血素和重組菌毛蛋白與虹鱒抗ASM血清的反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備的虹鱒抗滅活ASM血清可與兩種重組蛋白發(fā)生陽性反應(圖1，泳道3，4)，說明這兩種重組蛋白具有良好的免疫原性和反應原性，能有效誘導魚體分泌產(chǎn)生特異性抗體。

2.3 重組溶血素和重組菌毛蛋白的免疫保護效果比較分析

免疫保護試驗結(jié)果顯示，在攻毒后4 d PBS對照組魚體開始死亡，死亡率在兩周內(nèi)迅速升高，累積死亡率于16 d達到最高96%，而免疫組與對照組相比死亡率顯著降低，注射重組溶血素、重組菌毛蛋白及兩者1∶1 (W∶W)混合物、甲醛滅活全菌魚體的最終累積死亡率分別為34%、60%、24%和20%，其對虹鱒的相對免疫保護率分別為64.6%、37.5%、75.0%和79.2%(圖2)，其中重組溶血素對虹鱒的免疫保護效果顯著高于重組菌毛蛋白，將兩者混合共免疫虹鱒的免疫保護效果最高。

M：蛋白質(zhì)Marker；1：純化的重組溶血素；2：純化的重組菌毛蛋白；3：虹鱒抗滅活ASM血清與重組溶血素的反應結(jié)果；4：虹鱒抗滅活ASM血清與重組菌毛蛋白的反應結(jié)果

圖2 不同免疫組對虹鱒抗殺鮭氣單胞菌感染的免疫保護效果

2.4 ELISA檢測免疫后特異性抗體水平變化

ELISA結(jié)果顯示，與PBS對照組相比，重組溶血素和重組菌毛蛋白單獨免疫組虹鱒均能有效誘導抗各自抗原的特異性抗體水平，在免疫后2周兩者的特異性抗體水平均顯著高于對照組(P>0.05)，其水平在免疫后6周內(nèi)逐漸升高；重組溶血素和重組菌毛蛋白共免疫組虹鱒血清中抗重組溶血素或重組菌毛蛋白特異性抗體水平在免疫后6周內(nèi)也呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，其中抗重組菌毛蛋白抗體水平與重組菌毛蛋白單獨免疫組不存在顯著性差異變化，但抗重組溶血素抗體水平顯著高于重組溶血素單獨免疫組(圖3)。

不同字母標注代表組間存在顯著性差異(P<0.05)

2.5 重組溶血素和重組菌毛蛋白誘導虹鱒的免疫相關基因表達特性

熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，3個免疫組中IL-6、IL-8、TCR及CD4基因的表達水平均高于PBS對照組，其中重組溶血素與重組菌毛蛋白共免疫組中IL-6、CD4、MHC-Ⅱ及IgM基因表達水平顯著高于其他免疫組，另外發(fā)現(xiàn)重組菌毛蛋白免疫組中IL-6和IL-8基因表達水平顯著高于重組溶血素免疫組(圖4)。

*代表表達水平顯著高于PBS對照組(P<0.05)，不同字母代表各免疫組組間表達水平存在顯著性差異(P<0.05)，水平基線表示將PBS對照組各基因的表達水平設定為1

3 討論

亞單位由于其抗原組分特異單一，可誘導宿主針對關鍵靶標抗原產(chǎn)生特異性抗體，且具有安全性高、毒副作用小的優(yōu)點，已成為疫苗研究重要方向之一[14]。利用生物信息學分析病原微生物的毒力相關因子，結(jié)合運用反向疫苗學技術研究篩選具有免疫保護效果的候選靶標抗原，已成為亞單位疫苗研發(fā)的重要技術途徑[15,16]。目前，在該技術的應用下已針對弧菌、遲緩愛德華氏菌、鏈球菌、氣單胞菌等水產(chǎn)動物重要病原菌，研究篩選到一大批具有較好免疫保護效果與開發(fā)應用價值的亞單位候選抗原[17-20]。本研究基于殺鮭氣單胞菌全基因組信息，分別克隆表達了與菌體毒力相關的溶血素蛋白和菌毛蛋白，通過免疫保護性試驗驗證了兩者的免疫保護力，其中重組溶血素蛋白表現(xiàn)出較高的免疫保護效果，且能誘導魚體產(chǎn)生較高的特異性抗體水平。溶血素作為病原菌的重要毒力因子之一，可通過與紅細胞膜表面的受體結(jié)合，使細胞膜的通透性發(fā)生改變，進而使紅細胞破裂溶解，同時能夠引起魚體明顯的細胞免疫和體液免疫[21,22]。與本研究相似，對斑點叉尾免疫接種重組嗜水氣單胞菌溶血素蛋白也可誘導魚體產(chǎn)生顯著的免疫保護效果[23]。另外，利用無乳鏈球菌的重組溶血素蛋白免疫羅非魚也能誘導魚體產(chǎn)生70%的免疫保護率，免疫魚體在28 d后血清抗體效價高達1∶4 096[24]。以上結(jié)果均表明，殺鮭氣單胞菌溶血素蛋白具有較強的免疫原性，可誘導魚體產(chǎn)生較強的體液免疫應答和免疫保護效果，是亞單位疫苗研發(fā)的重要候選抗原之一。

亞單位疫苗由于其組分單一，單獨免疫往往難以取得高效的免疫效果，需要輔以一定的佐劑分子以提升其免疫保護效果[25]。菌毛作為菌體重要表面抗原，參與細菌的粘附定植，與致病力有直接的相關性[26]。本研究利用殺鮭氣單胞菌重組菌毛蛋白免疫虹鱒后，能有效刺激魚體產(chǎn)生體液免疫應答，說明其具有一定的免疫原性，同時也能誘導魚體產(chǎn)生一定的免疫保護效果，這與前期有關嗜水氣單胞菌菌毛蛋白的研究相似[27]，但是對比重組溶血素來說，重組菌毛蛋白誘導的免疫保護率相對較低。本研究還發(fā)現(xiàn)，以重組菌毛蛋白與重組溶血素混合免疫魚體后，可誘導魚體產(chǎn)生更高水平的免疫保護效果，以及更高水平抗溶血素特異性抗體，表明重組菌毛蛋白具有一定的佐劑效應。前期研究顯示，菌毛蛋白可激活Toll樣受體信號通路，從而影響機體免疫應答水平[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，當重組菌毛蛋白與重組溶血素共免疫時，不僅可誘導產(chǎn)生較高的抗體水平和免疫保護效果，IL-6、CD4、MHC-Ⅱ等多個參與炎癥響應和抗原遞呈的免疫相關基因表達水平也顯著高于其他免疫組，結(jié)果表明共免疫菌毛蛋白可有效提升亞單位疫苗的免疫效果。但是，本研究對兩種重組蛋白僅采用1∶1的比例進行混合免疫，未能進一步細化不同配比研究，以獲得更佳的免疫保護效果，這方面仍有待進一步研究。

4 結(jié)論

殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種的重組溶血素對虹鱒具有較好的免疫保護效果，是具有亞單位疫苗開發(fā)應用前景的潛在靶標抗原。重組菌毛蛋白與重組溶血素蛋白共免疫魚體可顯著提升免疫保護效果及魚體的免疫應答強度，提示菌毛蛋白具有開發(fā)成為佐劑分子的潛在價值。研究結(jié)果將為殺鮭氣單胞菌亞單位疫苗的研究提供重要參考。