◆作者：李金敏

◆單位：山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室；山東寶來利來生物工程股份有限公司

禽致病性大腸桿菌是禽類重要的腸外致病菌之一，可以引起禽大腸桿菌病。該病多發(fā)生于冬春季節(jié)及氣溫多變時期，常與其它呼吸道疾病混合或繼發(fā)感染，引起禽類全身性感染，嚴重可引起敗血癥導致死亡，給養(yǎng)殖業(yè)帶來慘重的經(jīng)濟損失（孫暢等，2017；Ugwu 等，2020）。近年由于抗生素的無節(jié)制使用導致大腸桿菌耐藥菌株層出不窮，逐漸削弱了抗生素的治療效果（高海濤等，2017；Robin 等，2020）。而噬菌體作為抗生素的替代品之一，因具有殺菌迅速、特異性強，不影響體系正常菌群平衡等優(yōu)勢而備受關注（羅巧慧等，2020）。目前關于噬菌體的研究主要集中在生物學特性及基因組學等方面的研究，針對噬菌體發(fā)酵及后處理工藝的研究極少，以致于噬菌體制劑普遍存在效價低,貯存穩(wěn)定性差等問題，極大程度上限制了噬菌體制劑的規(guī)?；a(chǎn)及推廣應用（于浩等，2017；汪祥燕等，2018）。

提升噬菌體制劑效價可通過提高發(fā)酵效價及減少凍干、貯存損失來解決。提高噬菌體發(fā)酵效價可通過優(yōu)化一系列發(fā)酵參數(shù)來調(diào)控發(fā)酵過程，進而提高噬菌體的發(fā)酵密度。減少凍干貯存損失可通過優(yōu)化噬菌體凍干保護劑提高凍干及貯存存活率（Manohar 等，2019；Eva 等，2018）。

本研究所用噬菌體Ecp-2原發(fā)酵效價為109pfu/mL，使用常規(guī)凍干保護劑凍干，凍干粉存活率約為30%，且貯存損失嚴重。因此，本研究在該噬菌體現(xiàn)有發(fā)酵工藝的基礎上，通過對發(fā)酵過程中宿主菌接種量、發(fā)酵液pH值、通氣量等參數(shù)進行調(diào)控以及凍干保護劑配方的優(yōu)化，以期從技術層面提高噬菌體發(fā)酵液及凍干粉效價，降低噬菌體制劑的成本、提高產(chǎn)品穩(wěn)定性，為噬菌體制劑的規(guī)?；a(chǎn)及后續(xù)推廣應用奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 菌毒株

宿主菌株B0080、及相應的噬菌體Ecp-2 由山東寶來利來生物工程股份有限公司菌種保藏中心保存。

1.2 主要試劑

TSA、TSB 培養(yǎng)基、葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉、酵母膏、脫脂奶粉、海藻糖、硫代硫酸鈉、谷氨酸鈉。

1.3 主要儀器耗材

FDU-1100 真空冷凍干燥機（日本東京理化）、HPX-9082 MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博訊實業(yè)）、GZX-9140 MBE 電熱鼓風干燥箱、TCYQ DHZ-CA 大容量振蕩器（太倉實驗設備廠），超低溫冰箱，高速冷凍離心機（長沙英泰儀器）等。

1.4 噬菌體Ecp-2 發(fā)酵工藝優(yōu)化

1.4.1 宿主菌接種量及發(fā)酵時間的確定

宿主菌初始活菌數(shù)為2.5×109cfu/mL, 分別按照裝液量的1%、5%、10%進行接種，噬菌體按照該噬菌體最佳感染復數(shù)（噬菌體/ 宿主菌=10∶3） 進行接種，分別在發(fā)酵1、2、3、4、5、6、7h取樣測定發(fā)酵液噬菌體效價。

1.4.2 發(fā)酵液pH 值調(diào)控

通氣量1∶1，宿主菌5%接種量，噬菌體接種量按照最佳感染復數(shù)接種。發(fā)酵過程中使用NaOH 溶液使發(fā)酵罐內(nèi)發(fā)酵液p H 分別維持在5.0、6.0、7.0、8.0，另設初始pH 為7，后續(xù)自然組作為對照。分別在發(fā)酵1、2、3、4、5h 取樣測定發(fā)酵液噬菌體效價。

1.4.3 通氣量的確定

宿主菌接種量按照裝液量5%、發(fā)酵液pH 為7、罐壓等均保持不變，調(diào)整上罐通氣量分別為1∶0.5、1∶1、1∶2.5，培養(yǎng)4.5h，測定發(fā)酵液噬菌體效價。

1.5 噬菌體Ecp-2 凍干保護劑篩選

1.5.1 凍干保護劑的篩選

通過實驗室前期試驗中對其他噬菌體具有較好凍干保護效果的4 種單因素：脫脂奶粉、海藻糖、硫代硫酸鈉、谷氨酸鈉進行四因素三水平的正交試驗設計。

1.5.2 凍干存活率測定

將噬菌體過濾液分裝于無菌的10mL 離心管中，每管1mL，按照要求加入相應組合的凍干保護劑。將制備好的噬菌體懸液置于-20℃超低溫冰箱內(nèi)預凍至完全凍結(jié)，將預凍樣品迅速轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥處理36～48h，使噬菌體凍干粉含水量2%～3%，測定凍干后噬菌體效價。凍干存活率計算公式為：

存活率（%）= 樣品凍干后效價/ 凍干前效價×100

1.6 噬菌體Ecp-2 凍干粉貯存穩(wěn)定性研究

將通過最佳發(fā)酵及后處理工藝制得的噬菌體Ecp-2 凍干粉以玉米淀粉作為載體稀釋至5 ×109cfu/g。 分別置于25、4、-20℃條件下貯存，每30d 取樣測定效價，實驗周期180d。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 接種量及發(fā)酵時間的確定

在宿主菌添加量一定的前提下，噬菌體按照最佳感染復數(shù)添加，可獲得最高效價（Abedon等，2016）。本研究通過調(diào)整宿主菌的初始接種量來調(diào)控發(fā)酵效價，如表2 所示，發(fā)酵至7h 發(fā)酵液效價最高1.50×1010pfu/mL，最高效價出現(xiàn)在宿主菌5%接種量、發(fā)酵2h，因此選擇宿主菌5%接種、噬菌體按照最佳感染復數(shù)進行接種，培養(yǎng)2h 為該噬菌體發(fā)酵終點。結(jié)果表明適當?shù)奶岣咚拗骶褪删w的整體接種比例有助于提高發(fā)酵效價，過量的提高初始接種量對效價的提升沒有正向作用，可能由于微生物密度過大競爭生存空間存在一定關系。

表1 正交試驗設計表

表2 宿主菌接種量對噬菌體效價影響（單位：pfu/mL）

2.1.2 發(fā)酵液pH 確定

如表3 所示，不同pH 條件下進行發(fā)酵，最高效價出現(xiàn)在pH=7.0，發(fā)酵2h，最高效價達3.5×1010pfu/mL。發(fā)酵過程中pH值設置過高、過低、或者不控制pH 值均會影響噬菌體的增殖，這與Grieco 的研究結(jié)果一致（Grieco 等，2009）。

表3 發(fā)酵pH 對噬菌體效價影響（單位：pfu/mL）

2.1.3 通氣量的確定

如表4 所示，不同通氣量條件下進行發(fā)酵，最高效價出現(xiàn)在通氣量1∶2.5，發(fā)酵2h，最高效價達5.0×1010pfu/mL?？赡芘c高通氣量加快了宿主菌的繁殖速度有關。

表4 發(fā)酵通氣量對噬菌體效價影響（單位：pfu/mL）

2.2 凍干保護劑配方優(yōu)化

采用4 因素3 水平正交試驗確定脫脂奶粉、海藻糖、硫代硫酸鈉、谷氨酸鈉的復合配方。由表中R 值可知四種組分對該噬菌體凍干存活率的影響順序為B>A>C>D。經(jīng)正交試驗優(yōu)化后最佳凍干保護劑配方組成為A2B3C2D2，該配方不在正交試驗所設組方中，因此選定該配方與正交試驗中凍干存活率最高組A2B3C3D3再次凍干進行驗證試驗。試驗結(jié)果如下表所示。采用正交試驗優(yōu)化后的配方A2B3C2D2對噬菌體Ecp-2 凍干保護率為79.20%，略高于配方A2B3C3D3。

表5 正交設計凍干保護劑配方對噬菌體凍干存活率影響

表6 配方驗證試驗結(jié)果

2.3 噬菌體Ecp-2 凍干粉貯存穩(wěn)定性

由表7 噬菌體在不同溫度貯存穩(wěn)定性結(jié)果可見，凍干粉在-20℃貯存6 個月效價幾乎未發(fā)生變化；在4℃貯存6 個月噬菌體效價略有降低，存活率仍在89%以上；在25℃效價急速下降。以上結(jié)果說明噬菌體適合在低溫貯存，且該保護劑可有效延長貯存時間。

表7 凍干粉在不同溫度條件下貯存穩(wěn)定性

3 結(jié)論

3.1 噬菌體發(fā)酵工藝優(yōu)化

在實驗室前期摸索出的噬菌體發(fā)酵工藝及培養(yǎng)基配方的基礎上對該噬菌體發(fā)酵工藝進一步優(yōu)化，確定噬菌體Ecp-2 最佳發(fā)酵條件為：宿主菌接種量為種子液濃度2.5×109CFU/mL，按照裝液量5%接種；噬菌體按照最佳感染復數(shù)（噬菌體/ 宿主菌=10-3）進行接種；培養(yǎng)溫度37℃；發(fā)酵液pH 控制在7.0、通氣量1∶2.5，培養(yǎng)2h，發(fā)酵液效價維持在5.0×1010cfu/mL 左右。

3.2 凍干保護劑的篩選

通過正交試驗確定該噬菌體最優(yōu)凍干保護劑配方為：脫脂奶粉15%、海藻糖9%、硫代硫酸鈉5%、谷氨酸鈉3%，采用該保護劑配方進行凍干, 噬菌體存活率達79.20%， 凍干粉效價達2.0×1011pfu/g，該配方可應用于噬菌體的規(guī)?；a(chǎn)。

3.3 噬菌體貯存穩(wěn)定性

噬菌體凍干粉由載體稀釋后在不同溫度條件下存放，在-20℃條件下貯存180d 噬菌體效價與初始相比未發(fā)生明顯改變；4℃條件下貯存180d 噬菌體存活率89%以上，及由此可說明該凍干保護劑不僅可減少凍干過程的損失，對于延長噬菌體制劑的貨架期也具有顯著效果。

參考文獻：（略）