賈永利， 左憲宏， 楊新明， 張培楠， 孟憲勇， 胡長波

(1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨外科， 河北 張家口 075000 2.張家口學(xué)院， 河北 張家口 075000)

布魯桿菌病是一種全球常見的細(xì)菌性人畜共患病，能夠影響多種器官和組織，引起一系列臨床表現(xiàn)[1]。骨關(guān)節(jié)受累是布魯桿菌最常見的并發(fā)癥，發(fā)生率為10%-85%，而布魯桿菌性脊柱炎(BS)是較為嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]。BS臨床表現(xiàn)復(fù)雜，鑒別診斷難度較大，極易發(fā)生誤診、誤治，從而延誤治療時機(jī)，導(dǎo)致病情反復(fù)發(fā)展，影響患者健康和正常生活[3]。了解BS發(fā)病相關(guān)機(jī)制可能為BS診斷和治療提供理論基礎(chǔ)。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是一種來源于初始T細(xì)胞的CD4+T效應(yīng)細(xì)胞亞群，通過分泌白細(xì)胞介素(IL)-17A、IL-22等細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。研究表明，Th17細(xì)胞與布魯桿菌病的免疫反應(yīng)有關(guān)[5]。IL-23屬于IL-12異源二聚體細(xì)胞因子家族，主要由巨噬細(xì)胞、活化的樹突狀細(xì)胞及單核細(xì)胞等產(chǎn)生，作用于Th17細(xì)胞，在免疫性疾病的發(fā)病中有重要的作用[6]。目前，對IL-23、Th17在BS發(fā)病中的作用尚不清楚，本研究通過分析BS患者IL-23、Th17的水平，探討二者與BS發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2015年1月至2020年4月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的111例BS患者為研究對象，其中男78例，女33例，年齡23～78歲，平均年齡(50.78±7.29)歲，其中70例患者有家畜飼養(yǎng)史或接觸史，13例患者有食用生奶/未熟肉史，28例患者致病原因不明確。同期選取醫(yī)院健康體檢對象120例為對照組，其中男85例，女35例，年齡22～79歲，平均年齡(50.15±7.79)歲。兩組受試者年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。所有受試對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)通過。BS診斷符合《布魯菌病診療專家共識》中的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[7]，結(jié)合流行病學(xué)史、實(shí)驗(yàn)室檢查及臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合判斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①實(shí)驗(yàn)室檢查證實(shí)布魯桿菌感染(布魯桿菌病依靠臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，其中實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括試管凝集試驗(yàn)，補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)以及布病抗-人免疫球蛋白實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合病原學(xué)檢查)；②MRI檢測證實(shí)有實(shí)質(zhì)性脊柱損害；③治療前患者未曾服用免疫功能藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫抑制劑進(jìn)行免疫治療；④患者均住院接受抗生素治療10d左右。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他可導(dǎo)致骨損害的疾??；②銀屑病等其他自身免疫性疾病患者；③重大臟器功能不全者；④有慢性感染史患者；⑤合并惡性腫瘤患者。病程在6個月以內(nèi)痊愈為急性期，超過6個月仍未痊愈為慢性期，其中急性期患者61例(急性期組)，慢性期患者50例(慢性期組)。

1.2主要試劑及儀器:淋巴細(xì)胞分離液(北京索萊寶科技有限公司，批號P9240)；佛波酯(PMA)、離子霉素、莫能霉素(美國sigma公司，批號P8139-1MG、P3011-4M、P5719-5J)；破膜劑(Fix/Perm)、固定劑/破膜劑(Perm/Wash)(美國BD公司，批號50-GAS037、70-GAS049)；鼠抗人CD3-FITC抗體、鼠抗人CD4-PE抗體、鼠抗人IL-17-PerCP抗體(武漢艾美捷科技有限公司，批號ANT-137、ANT-237、ANT-224)；IL-23、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-17、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(英國abcam公司，批號ab203719、ab601315、ab312297、ab561479、ab103572)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司，型號FACSCanto)。

1.3方 法

1.3.1實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測:對BS患者治療前血清試管凝集試驗(yàn)(SAT)滴度、C反應(yīng)蛋白(CRP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)水平進(jìn)行檢測。

1.3.2血液樣本采集:對照組于體檢當(dāng)日清晨、BS患者于住院次日清晨治療前抽取空腹靜脈血6mL，其中3mL裝至普通離心管中，4℃ 3000rpm離心5min，分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ溆嘌貉b至EDTA抗凝管中，立即用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.3.3ELISA法檢測血清細(xì)胞因子水平:對血清IL-23、TNF-α、IL-17、MMP-2、RANKL水平進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.4外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離:將采集的EDTA抗凝血與等體積PBS緩沖液混勻稀釋；滅菌管中加入5mL淋巴細(xì)胞分離液，之后加入稀釋好的EDTA抗凝血，1500rpm離心30min，梯度法分離PBMC。

1.3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17細(xì)胞:取PBMC細(xì)胞懸液，PBS清洗2次，1500rpm離心5min，棄上清；震蕩混勻后取200μL加入流式管中；依次加入PMA、離子霉素、莫能霉素，37℃、5%CO2孵育4h；收集細(xì)胞，1500rpm離心5min，棄上清；PBS重懸細(xì)胞；加入鼠抗人CD3-FITC、CD4-PE抗體，混勻，避光孵育20min；PBS清洗2次，棄上清；加入1mL Fix/Perm溶液，混勻，4℃遮光孵育30min；PBS清洗；加入1mL Perm/Wash溶液，4℃，1500rpm離心5min，棄上清；加入2mL Perm/Wash溶液，4℃，1500rpm離心5min，棄上清；加入80μL Perm/Wash溶液，10μL鼠抗人IL-17-PerCP抗體，混勻，4℃遮光孵育30min；PBS洗滌2次，棄上清；加入PBS重懸細(xì)胞，混勻后流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞。

2 結(jié) 果

2.1慢性期組和急性期組一般資料比較:與慢性期組比較，急性期組年齡、性別、流行病學(xué)史差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；急性期組SAT滴度≥1∶100、CRP≥5mg/L、ESR≥20mm/h患者比例均高于慢性期組(P<0.05)。見表1。

2.2各組血清RANKL、MMP-2水平比較:與對照組比較，慢性期組、急性期組血清RANKL、MMP-2水平均升高(P<0.05)；與慢性期組比較，急性期組血清RANKL、MMP-2水平均升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清RANKL MMP-2水平比較

2.3各組血清IL-23、Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平比較:與對照組比較，慢性期組、急性期組Th17細(xì)胞、血清TNF-α、IL-17、IL-23水平均升高(P<0.05)；與慢性期組比較，急性期組Th17細(xì)胞、血清TNF-α、IL-17、IL-23水平均升高(P<0.05)。見表3。

表3 各組血清IL-23 Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平

2.4BS患者血清IL-23與Th17細(xì)胞水平的相關(guān)性:BS患者血清IL-23與Th17細(xì)胞水平呈正相關(guān)(r=0.657，P=0.000)。見圖1。

圖1 BS患者血清IL-13與Th17細(xì)胞水平的相關(guān)性

2.5BS患者血清IL-23、Th17與RANKL、MMP-2的相關(guān)性:BS患者血清IL-23與RANKL、MMP-2水平呈正相關(guān)(P<0.05)，Th17細(xì)胞與RANKL、MMP-2水平也呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 BS患者血清IL-23 Th17細(xì)胞與RANKL MMP-2的相關(guān)性

3 討 論

BS是布魯桿菌病嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，主要是由于患者椎體、椎管、椎旁組織、間盤、韌帶等受到布魯桿菌侵襲，繼而產(chǎn)生炎性反應(yīng)、膿性反應(yīng)等造成的感染性疾病。本研究急性期組SAT滴度≥1∶100、CRP≥5mg/L、ESR≥20mm/h患者比例均高于慢性期組，提示急性期BS患者較慢性期患者存在嚴(yán)重的免疫性反應(yīng)。Th17細(xì)胞是一種CD4+T細(xì)胞，能夠分泌IL-17、TNF-α等多種細(xì)胞因子，在多種宿主機(jī)制防御體制及炎癥性疾病中發(fā)揮重要的作用[8]。本研究結(jié)果表明BS患者Th17細(xì)胞、血清IL-17、TNF-α水平高于對照組，且急性期BS患者高于慢性期患者，與韓麗紅等[9]研究結(jié)果一致，提示Th17細(xì)胞、IL-17、TNF-α可能與BS發(fā)病有關(guān)。

成骨細(xì)胞是唯一參與骨沉積的骨細(xì)胞，破骨細(xì)胞是人體內(nèi)主要的骨吸收細(xì)胞，布魯桿菌能夠抑制成骨細(xì)胞骨基質(zhì)沉積，產(chǎn)生MMP，分泌細(xì)胞因子，導(dǎo)致骨基質(zhì)的降解，同時布魯桿菌能夠增加破骨細(xì)胞活性，促進(jìn)骨吸收[10]。RANKL能夠刺激骨細(xì)胞分化，是骨細(xì)胞中的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子，導(dǎo)致骨破壞[11]。布魯桿菌能夠促進(jìn)骨細(xì)胞中RANKL表達(dá)的增加，從而誘導(dǎo)骨吸收和骨破壞[12]，引起脊柱炎等布魯桿菌骨病的發(fā)生。本研究結(jié)果表明BS患者血清RANKL、MMP-2水平高于對照組，且急性期BS患者高于慢性期患者，提示布魯桿菌可能對BS患者成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞有一定的影響。研究表明IL-17與RANKL的表達(dá)及活性有關(guān)，能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和骨吸收[13]。TNF-α是一種參與多種炎癥反應(yīng)的細(xì)胞因子，在骨代謝中起著重要作用，其不僅是骨吸收誘導(dǎo)因子，在RANKL條件下，還能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體直接轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞[14]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)BS患者Th17細(xì)胞與RANKL、MMP-2呈正相關(guān)，提示Th17可能通過影響B(tài)S患者成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞進(jìn)而參與BS的發(fā)病，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

IL-23是一種異二聚體細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，BS患者血清IL-23水平升高，且急性期BS患者高于慢性期患者，提示IL-23可能參與BS的發(fā)病。IL-23可以通過誘導(dǎo)IL-17A、IL-22等下游細(xì)胞因子作用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，進(jìn)而影響骨吸收與骨形成[15]。本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，BS患者血清IL-23水平與Th17細(xì)胞呈正相關(guān)，且IL-23與RANKL、MMP-2水平呈正相關(guān)，提示IL-23可能通過影響Th細(xì)胞的增殖進(jìn)而促進(jìn)IL-17、TNF-α等細(xì)胞因子的釋放，影響成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞活性，從而在BS發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定的作用。

綜上所述，IL-23、Th17與BS的發(fā)生有關(guān)，可能是IL-23誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分泌細(xì)胞因子參與布魯桿菌引起的機(jī)體免疫病理損傷，進(jìn)而引起B(yǎng)S的發(fā)生。然而本研究僅對不同分期的BS患者血清IL-23、Th17及相關(guān)細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。