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電針調(diào)控TXNIP/NLRP3通路介導(dǎo)的焦亡途徑對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護(hù)作用研究

2021-08-28 00:55鄧寒冰李春琴金祖敏
河北醫(yī)學(xué) 2021年8期
關(guān)鍵詞:三針焦亡神經(jīng)細(xì)胞

鄧寒冰, 李春琴, 張 粲, 金祖敏

(1.海南省??谑械谌嗣襻t(yī)院針灸理療科, 海南 ???571100 2.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院針灸科, 海南 ???571100 3.云南中醫(yī)藥大學(xué)推拿基礎(chǔ)教研室, 云南 昆明 650500 4.貴州省織金縣中醫(yī)院治未病科, 貴州 畢節(jié) 552100)

新生兒缺氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain damage,HIBD)為圍生期窒息等引起的腦血流分布不平衡、腦動(dòng)脈供血減少所致的病理?yè)p傷,可造成癲癇、腦癱等神經(jīng)功能障礙性后遺癥,嚴(yán)重者導(dǎo)致新生兒死亡[1]。HIBD涉及炎癥、自噬、氧化應(yīng)激等機(jī)制參與,其中炎癥所致神經(jīng)細(xì)胞破壞及死亡為HIBD繼發(fā)后遺癥難以治療的原因[2]。硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)為硫氧還蛋白(thioredoxin,Trx)的內(nèi)源性抑制劑,可抑制Trx清除活性氧的抗氧化功能,導(dǎo)致Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性途徑的激活,誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡,是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵機(jī)制之一[3]。NLRP3炎性小體在HIBD大鼠中處于活化狀態(tài),可能介導(dǎo)缺氧缺血引起的神經(jīng)元細(xì)胞病變,參與HIBD發(fā)生與發(fā)展[4]。而抑制TXNIP/NLRP3信號(hào)通路,可減輕腦缺血所致神經(jīng)炎癥,改善HIBD新生大鼠細(xì)胞炎性焦亡,減輕腦損傷[5]。電針為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)針灸的一種形式,被應(yīng)用于癲癇、腦血管意外后遺癥、神經(jīng)官能癥等疾病的治療,臨床及動(dòng)物研究顯示,電針對(duì)腦卒中患者和腦缺血缺氧大鼠的神經(jīng)功能均有明顯改善作用[6],可減輕神經(jīng)細(xì)胞炎癥及凋亡等,然而其具體機(jī)制不清楚。本研究從TXNIP/NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑為切點(diǎn),探討電針是否能通過(guò)調(diào)控TXNIP/NLRP3細(xì)胞焦亡通路減輕HIBD所致腦損傷。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物:新生7日齡SD大鼠,SPF級(jí),體重(14±2)g,購(gòu)自江蘇兆生源生物技術(shù)有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(蘇)2018-0014,動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2018-0027,動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):C006317。將新生大鼠在動(dòng)物房中與孕鼠一起適應(yīng)飼養(yǎng)一周,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器:TXNIP陰性對(duì)照CRISPR質(zhì)粒(TXNIP NC CRISPR質(zhì)粒)、TXNIP過(guò)表達(dá)CRISPR質(zhì)粒(TXNIP OE CRISPR質(zhì)粒)(購(gòu)自上海吉瑪基因公司,批號(hào)C03019、C05113);紅四氮唑(TTC)試劑盒、蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、尼氏(Nissl)染色試劑盒、TUNEL檢測(cè)試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(IL-18)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(購(gòu)自上海碧云天公司,批號(hào):AF813、P7219-2、C0812、C1092D、SF20117、SF60113);DAPI試劑盒、蛋白提取試劑盒(購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司,批號(hào):BC4027、BC6028);含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(cleaved-caspase-1)、天冬氨酸蛋白水解酶-1前體(pro-caspase-1)、TXNIP、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)、NLRP3、β-actin單克隆抗體、羊抗鼠二抗(購(gòu)自美國(guó)Santa cruz公司,批號(hào):SC-1009、SC-1063、SC-2035、SC-50117、SC-50223、SC-00019、SC-00013);電子針灸儀(四川恒明醫(yī)療器械有限公司,型號(hào):HM6805-I);光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司,型號(hào):E200);熒光顯微鏡(北京上光儀器有限公司,型號(hào):XSP-SG-63XF);電泳儀(濟(jì)南童鑫生物科技有限公司,型號(hào):DYCP-31DN);凝膠成像儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器股份公司,型號(hào):GelSMART);酶標(biāo)儀(上海美谷分子儀器有限公司,型號(hào):SpectraMax iD3)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型制備、分組及處理:將75只新生大鼠隨機(jī)抽取15只作為假手術(shù)(Sham)組,其余60只新生大鼠采用改良RICE法復(fù)制HIBD大鼠模型[7],即雙重結(jié)扎左頸總動(dòng)脈并在結(jié)扎處之間切斷血管,認(rèn)真縫合皮膚后保溫恢復(fù)1h,而后置于含8%氧氣和92%氮?dú)獾耐该骱兄腥毖?.5h。HIBD大鼠模型制備成功后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為HIBD組(僅造模,不進(jìn)行其他處理)、電針組:造模后,根據(jù)《靳三針問(wèn)答圖解》《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》并結(jié)合人與大鼠骨密度類(lèi)比定位穴位,選取腦三針、智三針、顳三針穴位,針刺后連接電針儀行電針治療,1次/d,每次20min,共治療2周,并于每周第1天2%異氟烷吸入麻醉大鼠,借助腦立體定位儀和顯微注射器,在電針治療前6h經(jīng)腦室注射2L注射無(wú)菌生理鹽水,共2次)、電針+TXNIP NC組[電針治療方法同電針組,在電針治療期間,于每周第1天麻醉大鼠后,借助腦立體定位儀和顯微注射器,經(jīng)腦室注射2 L TXNIP NC CRISPR質(zhì)粒(1 nmoL/L),共注射2次]和電針+TXNIP OE組[電針治療方法同電針組,在電針治療期間,于每周第1天麻醉大鼠后,借助腦立體定位儀和顯微注射器,經(jīng)腦室注射2 L TXNIP OE CRISPR質(zhì)粒(1 nmoL/L),共注射2次],每組15只。Sham組僅暴露左頸總動(dòng)脈,不結(jié)扎和缺氧,造模結(jié)束后不進(jìn)行電針干預(yù)和腦室注射。

1.3.2莫里斯水迷宮測(cè)試:電針治療后,每組隨機(jī)取5只大鼠,根據(jù)文獻(xiàn)采用莫里斯水迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)記憶能力[8],共對(duì)大鼠進(jìn)行7d的測(cè)試。每次試驗(yàn)時(shí),將大鼠在四個(gè)象限中釋放點(diǎn)之一放入水中,讓其自主尋找平臺(tái)。視頻記錄測(cè)試過(guò)程中大鼠所有活動(dòng),并通過(guò)視頻跟蹤系統(tǒng)分析其游泳路徑,記錄其逃避潛伏期。第7天將平臺(tái)撤掉,記錄其穿越平臺(tái)的次數(shù)。所有試驗(yàn)最多持續(xù)60s,若超出60s則將大鼠手動(dòng)引導(dǎo)至平臺(tái)。

1.3.3樣本采集及TTC染色:末次電針治療12h后,各組大鼠均腹腔注射100mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死。隨機(jī)取5只,經(jīng)心臟灌注4℃預(yù)冷的磷酸緩沖液,斷頭取腦,借助切片模具自額極將大腦進(jìn)行冠狀切片(2mm/片),所有切片均浸沒(méi)在2% TTC溶液中,室溫避光孵育20min,轉(zhuǎn)至4%多聚甲醛溶液中固定,排列整齊拍照,采用ImageJ軟件分析,計(jì)算腦梗死體積,腦梗死體積=(5張切片白色梗死面積之和/5張切片總腦面積之和)×100%。其余5只斷頭取腦、摘離出梗死側(cè)海馬組織,每只取約2cm3組織塊、切碎后于液氮速凍,-80℃保存待測(cè)。剩余海馬組織用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定后,制備石蠟切片(10m/片)。

1.3.4HE染色及Nissl染色:將1.3.4中部分切片分別采用HE試劑盒和Nissl試劑盒染色,封片后觀察。在光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。每組至少觀察6張切片。

1.3.5免疫熒光檢測(cè):對(duì)1.3.4中石蠟切片按順序進(jìn)行脫蠟、檸檬酸鹽緩沖液抗原修復(fù)、含0.1% Triton X-100 PBS溶液通透、2%山羊血清封閉、滴加TUNEL試劑盒工作液后,加入cleaved-caspase-1一抗(1∶200)4℃孵育過(guò)夜,加入羊抗鼠二抗(1∶500)室溫避光孵育45 min,加入DAPI試劑避光孵育6 min,加入封閉液并封片。放在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞焦亡率,細(xì)胞焦亡率(%)=(cleaved-caspase-1+TUNEL+DAPI+細(xì)胞數(shù)量/DAPI+細(xì)胞數(shù)量)×100%,每組至少10張切片,每個(gè)切片觀察5個(gè)視野計(jì)算平均值。

1.3.6蛋白免疫印跡檢測(cè):研缽粉碎海馬樣品后采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白質(zhì),BCA法測(cè)定濃度,各組取30g煮沸變性,依次進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,半干法轉(zhuǎn)膜,奶粉封閉。加入一抗cleaved-caspase-1(1∶1000)、pro-caspase-1(1∶2000)、TXNIP(1∶1000)、ASC(1∶2000)、NLRP3(1∶2000)和β-actin(1∶2500)一抗4℃過(guò)夜孵育。第2天用1×Tris緩沖液洗膜3次,將膜放入相應(yīng)二抗(1∶5000)中,室溫孵育1.5h,再次洗膜3次后,加入發(fā)光液顯影,TANON成像系統(tǒng)采集圖像,并采用自帶軟件分析條帶灰度值,計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7ELISA檢測(cè):取1.3.5中海馬冷凍樣品,按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行處理,依次加入工作液、終止液,于酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)各孔吸光值,根據(jù)事先制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各大鼠海馬中IL-1β、IL-18水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠腦梗死體積比較:與Sham組比較,HIBD組腦梗死體積明顯增大(P<0.05);與HIBD組比較,電針組、電針+TXNIP NC組腦梗死體積減小(P<0.05);與電針組、電針+TXNIP NC組比較,電針+TXNIP OE組腦梗死體積增大(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表1。

表1 各組大鼠腦梗死體積學(xué)習(xí)記憶能力及細(xì)胞焦亡的比較

圖1 各組大鼠腦梗死體積比較(TTC染色)

2.2各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較:與Sham組比較,HIBD組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)明顯減少,逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05);與HIBD組比較,電針組、電針+TXNIP NC組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)增多,逃避潛伏期縮短(P<0.05);與電針組、電針+TXNIP NC組比較,電針+TXNIP OE組穿越平臺(tái)的次數(shù)減少,逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠海馬區(qū)病理?yè)p傷觀察:Sham組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列規(guī)則致密,胞核染色均勻,胞質(zhì)邊界清晰,形態(tài)正常;HIBD組神經(jīng)細(xì)胞排列錯(cuò)亂疏松,胞核皺縮深染,胞質(zhì)邊界模糊,尼氏小體數(shù)量減少;與HIBD組比較,電針組和電針+TXNIP NC組海馬區(qū)細(xì)胞損傷均明顯改善,尼氏小體數(shù)量增多;與電針組和電針+TXNIP NC組比較,電針+TXNIP OE組海馬區(qū)細(xì)胞損傷加重,尼氏小體數(shù)量減少。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織Nissl染色和HE染色情況(×200)

2.4各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞焦亡比較:與Sham組比較,HIBD組海馬區(qū)cleaved-caspase-1+TUNEL+細(xì)胞明顯增多(P<0.05);與HIBD組比較,電針組、電針+TXNIP NC組海馬區(qū)cleaved-caspase-1+TUNEL+細(xì)胞減少(P<0.05);與電針組、電針+TXNIP NC組比較,電針+TXNIP OE組cleaved-caspase-1+TUNEL+細(xì)胞增多(P<0.05)。見(jiàn)圖3、表1。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)細(xì)胞焦亡情況(×200)

2.5各組大鼠海馬組織TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較:與Sham組比較,HIBD組大鼠海馬組織cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平明顯升高(P<0.05);與HIBD組比較,電針組、電針+TXNIP NC組大鼠海馬組織cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平降低(P<0.05);與電針組、電針+TXNIP NC組比較,電針+TXNIP OE組大鼠海馬組織cleaved-caspase-1/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4、表2。

表2 各組大鼠海馬組織TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

圖4 各組大鼠海馬組織TXNIP/NLRP3通路相關(guān)蛋白情況

2.6各組大鼠海馬組織IL-18 IL-1β水平比較:與Sham組比較,HIBD組大鼠海馬組織IL-18、IL-1β水平明顯升高(P<0.05);與HIBD組比較,電針組、電針+TXNIP NC組大鼠海馬組織IL-18、IL-1β水平減少(P<0.05);與電針組、電針+TXNIP NC組比較,電針+TXNIP OE組大鼠海馬組織IL-18、IL-1β水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠海馬組織IL-18 IL-1β水平比較

3 討 論

雖然圍產(chǎn)期監(jiān)測(cè)及醫(yī)療技術(shù)取得了重大進(jìn)步,HIBD仍是導(dǎo)致新生兒死亡和永久性神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的主要原因之一,并且沒(méi)有藥物或治療方式能夠持續(xù)改善圍產(chǎn)期HIE后嬰兒的長(zhǎng)期存活率[9],因此,尋找新療法成為必要。本研究通過(guò)采用改良RICE法復(fù)制HIBD大鼠模型,并分析電針對(duì)HIBD大鼠模型的作用機(jī)制,為HIBD的治療提供參考。海馬為負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)記憶的主要功能區(qū),外部信號(hào)傳遞到神經(jīng)中樞后在此進(jìn)行整合,發(fā)生損傷可引起學(xué)習(xí)記憶能力下降,而腦缺血缺氧極易造成海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞炎癥和焦亡。另有研究發(fā)現(xiàn),HIBD患兒的海馬區(qū)椎體細(xì)胞的生理特性和突觸傳遞功能受到破壞,呈現(xiàn)病理?yè)p傷[10]。本研究顯示,與Sham組比較,HIBD組大鼠腦梗死體積增加,穿越平臺(tái)的次數(shù)減少,逃避潛伏期延長(zhǎng),神經(jīng)細(xì)胞排列錯(cuò)亂疏松,胞質(zhì)邊界模糊,數(shù)量減少,顯示缺血缺氧可造成新生大鼠腦梗死,導(dǎo)致神經(jīng)功能和學(xué)習(xí)記憶能力弱化。已證實(shí),海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞炎癥和焦亡與缺血缺氧導(dǎo)致的腦損傷密切相關(guān)[11],本研究亦發(fā)現(xiàn),與Sham組比較,HIBD組海馬區(qū)cleaved-caspase-1+TUNEL+細(xì)胞顯著增多,提示缺血缺氧造成新生大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞炎癥及焦亡,與其腦損傷及學(xué)習(xí)記憶能力弱化有關(guān)。針刺主要通過(guò)對(duì)人體經(jīng)絡(luò)穴位進(jìn)行刺激,通過(guò)調(diào)氣血、通經(jīng)絡(luò)等實(shí)現(xiàn)改善臟器功能、治療疾病的目的,具有操作簡(jiǎn)單、安全經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。傳統(tǒng)針刺療法“靳三針”中的腦三針、智三針、顳三針在治療幼兒腦病方面已取得較為肯定的療效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦證明,“靳三針”針刺療法可促進(jìn)海馬神經(jīng)元自噬,阻止小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎性壞死,保護(hù)神經(jīng)功能,改善HIBD新生大鼠學(xué)習(xí)記憶和自主活動(dòng)能力[12]。電針為針刺的創(chuàng)新與改進(jìn),主要在毫針針刺的基礎(chǔ)加以電流刺激,已有研究表明,電針可能為促進(jìn)腦癱功能恢復(fù)的另一種治療選擇[13]。本研究對(duì)HIBD新生大鼠的腦三針、智三針、顳三針選穴進(jìn)行電針刺激,結(jié)果顯示,電針治療后,腦梗死體積及逃避潛伏期顯著降低,穿越平臺(tái)的次數(shù)增多,海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞損傷減輕,伴隨cleaved-caspase-1+TUNEL+細(xì)胞減少,表明電針治療可明顯抑制海馬細(xì)胞焦亡,減輕腦損傷,提高學(xué)習(xí)記憶能力。但其作用機(jī)制并不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn),依賴于炎癥的細(xì)胞焦亡為細(xì)胞死亡的另一種典型程序,TXNIP∕NLRP3通路通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞焦亡參與多種缺血缺氧所致器官損傷的發(fā)生和發(fā)展[14]。正常狀態(tài)下,TXNIP與還原型Trx結(jié)合,維持其抗氧化能力;缺血缺氧狀態(tài)下,機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平較高,Trx被氧化后TXNIP與之解離,轉(zhuǎn)而與NLRP3結(jié)合并誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化,隨之將pro-caspase-1剪切為具有活性的cleaved-caspase-1,介導(dǎo)細(xì)胞腫脹破碎,同時(shí)誘導(dǎo)IL-1β、IL-18等炎性因子產(chǎn)生,引起炎癥反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[15]。腦缺血再灌注所致神經(jīng)細(xì)胞損傷與NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡密切相關(guān)[10]。抑制TXNIP/NLRP3炎性體激活,可使缺血引起的腦梗死和水腫程度降低,組織病理學(xué)及神經(jīng)功能損傷改善。本研究發(fā)現(xiàn),相較于Sham組,HIBD組新生大鼠海馬中cleaved/pro-caspase-1、ASC、NLRP3、TXNIP蛋白及IL-18、IL-1β水平均增加,表明HIBD新生大鼠腦組織中TXNIP/NLRP3焦亡通路被活化。而電針治療后,海馬中cleaved/pro-caspase-1、ASC、TXNIP、NLRP3蛋白及IL-18、IL-1β水平均顯著低于HIBD組,推測(cè)電針可降低TXNIP表達(dá),進(jìn)而抑制NLRP3介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥及焦亡。為驗(yàn)證該猜想,本研究采用TXNIP CRISPR激活質(zhì)粒和電針聯(lián)合干預(yù)HIBD新生大鼠,結(jié)果顯示TXNIP OE CRISPR質(zhì)??赡孓D(zhuǎn)電針對(duì)NLRP3焦亡通路的抑制作用及對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的改善作用,進(jìn)一步證明電針可能通過(guò)抑制TXNIP/NLRP3通路,減輕焦亡,改善神經(jīng)細(xì)胞和腦損傷。綜上,本研究認(rèn)為電針可能通過(guò)抑制TXNIP/NLRP3通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡,減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷,改善HIBD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,然而HIBD涉及的病理過(guò)程較為復(fù)雜,電針改善HIBD神經(jīng)損傷的作用可能涉及其他機(jī)制,有待進(jìn)一步探究。

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