余 慶，劉明珠，李夢夢，黃帥帥,3，徐鳳巧，李鵬飛,3**

(1.廣西科學院，廣西壯族自治區(qū)漁業(yè)重大疫病防控與高效健康養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)技術(shù)工程研究中心，廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007；2.河南師范大學生命科學學院，河南新鄉(xiāng) 453007；3.北部灣大學海洋學院，廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護重點實驗室，廣西欽州 535011)

0 引言

我國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，但近年來水產(chǎn)病害的暴發(fā)和流行給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1,2]。其中，哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是海水養(yǎng)殖動物的主要致病菌之一，常見于廣西等華南沿海地區(qū)，嚴重威脅著該地區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[3-5]。目前主要采用抗生素等化學藥物治理水產(chǎn)養(yǎng)殖中的弧菌病，但化學藥物抗菌效果的持續(xù)時間短，且近年來抗生素的濫用加劇了病原菌耐藥性的產(chǎn)生，帶來了水產(chǎn)品有害藥物殘留等重大食品安全問題[6]。針對哈維氏弧菌的檢測方法主要包括：基于細菌生理生化反應(yīng)的檢測方法、基于抗體的免疫學檢測技術(shù)，以及聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)等[7-9]。這些方法雖然能精確診斷哈維氏弧菌，但存在操作繁瑣、檢測耗時長、試劑保存條件苛刻等不足，從而難以滿足在養(yǎng)殖現(xiàn)場快速、準確檢測哈維氏弧菌的要求?；【〉姆乐我恢笔撬『Ψ揽丶夹g(shù)研究的重點，而發(fā)展成本低、耗時短、操作便捷、靈敏度高的致病菌快速檢測技術(shù)，有助于及早發(fā)現(xiàn)、確定病原，進而制定精確的治療方案來控制病原擴散，降低水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟損失[10]。

指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)是一種生物文庫篩選技術(shù)，該技術(shù)使用容量高達1×1014-1×1015的隨機寡核苷酸文庫，在體外經(jīng)過多輪篩選，最終獲得能夠特異性識別靶物質(zhì)的單鏈寡核苷酸，即核酸適配體[11]。核酸適配體作為一種新型的識別分子，具有易篩選、易修飾、穩(wěn)定性強、高特異性識別靶標分子等優(yōu)點，目前已廣受關(guān)注并發(fā)展成為一類新型的檢測和治療工具[12-16]。通常，篩選核酸適配體只需要6-30個SELEX循環(huán)，時間僅為3-8周，遠低于制備生物抗體的時間(3-8個月)，而且可避免生物抗體存在的成本高、易失活、保存條件苛刻、批次間的抗體質(zhì)量存在差異等問題。另外，SELEX技術(shù)是在體外進行的化學篩選過程，因此靶標分子范圍廣范，包括金屬離子、有機染料等簡單體系，以及病毒、細胞、組織等復(fù)雜體系；特別是具有細胞毒性、無免疫原性或者弱免疫原性的靶標分子，使用SELEX技術(shù)可實現(xiàn)體外高特異性核酸適配體的篩選[11]。鑒于SELEX技術(shù)的優(yōu)點，核酸適配體的研究已受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注，并在生物化學、生物醫(yī)學、納米材料、蛋白質(zhì)科學等多學科得到迅速發(fā)展。但是，我國對核酸適配體應(yīng)用于水產(chǎn)病害防治領(lǐng)域的研究尚顯不足，待發(fā)展空間巨大。

本研究以哈維氏弧菌為靶標，利用SELEX技術(shù)篩選獲得可高特異性、高親和性識別哈維氏弧菌的核酸適配體，并對其性質(zhì)進行系統(tǒng)性分析，包括核酸適配體的特異性、細胞毒性和靶位點的性質(zhì)等，從而為水產(chǎn)病害的檢測和防控提供新思路、新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)從廣西北海市鐵山港海域網(wǎng)箱養(yǎng)殖的發(fā)病卵形鯧鲹中分離得到，編號為GT-V.harveyi1[17]。溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)從廣西欽州灣網(wǎng)箱養(yǎng)殖的發(fā)病卵形鯧鲹中分離得到，編號為TOQZ01[18]。嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)從廣西南寧池塘養(yǎng)殖的發(fā)病草魚中分離獲得。

實驗儀器：TS2倒置光學顯微鏡(日本Nikon公司)，ACSAria Ⅱ流式細胞儀(美國BD公司),Nano Drop one超微量分光光度計(美國Thermo公司),Mastercycler nexus gradient PCR儀(德國Eppendorf公司),AC2-4S1生物安全柜(新加坡ESCO公司),Centrifuge 5417R離心機(德國Eppendorf公司),Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),DK-8D水浴鍋(博訊公司)。試劑材料：鏈酶親和素標記的磁珠(美國Thermo公司)；PCR純化回收試劑盒、膠回收試劑盒、DL2000 Marker、DL50 bp Marker(日本TakaRa公司)。磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate Buffer Saline,PBS)：2 mmol/L KH2PO4，10 mmol/L Na2HPO4，137 mmol/L NaCl，pH值為7.2。

1.2 方法

1.2.1 隨機單鏈DNA文庫(ssDNA Library)和引物的設(shè)計合成

用于核酸適配體篩選的隨機單鏈DNA文庫(ssDNA Library)、引物和核酸適配體均委托北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。隨機起始單鏈DNA文庫中每條核酸單鏈均由中間50 bp的隨機核苷酸序列(N50)和兩端的固定核苷酸序列構(gòu)成(5′-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-N50-CGAA-GGACGCAGAGAAGTCTC-3′)。上游引物(Forward Primer,FP):5′-GACGCTTACTCAGGTGTGACTCG-3′，下游引物(Reverse Primer,RP)：5′-GAGACTTCATCTGCGTCCTTCG-3′。其中，上游引物5′端標記著羥基熒光素(6-carboxy-fluorescein labeled FP,FAM-FP)，下游引物5′端引物標記著生物素(Biotin labeled RP,biotin-RP)。

1.2.2 SELEX技術(shù)篩選特異性識別哈維氏弧菌的核酸適配體

以羥基熒光素(FAM)標記的隨機單鏈DNA文庫與哈維氏弧菌的孵育結(jié)合為對照(Con)，利用流式細胞術(shù)進行FAM熒光值檢測。4 nmol的起始文庫溶于1 000 μL PBS中，在92℃高溫變性10 min，然后迅速插入到冰中復(fù)性10 min；起始文庫與哈維氏弧菌在冰上孵育結(jié)合1 h；用PBS緩沖液離心清洗3次，隨后將其在92℃水浴中處理5 min，離心分離得到與哈維氏弧菌結(jié)合的ssDNA；將分離得到的ssDNA作為模板進行PCR擴增。PCR程序：預(yù)變性94℃ 2 min，擴增20個循環(huán)(94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃ 1 min)，終延伸72℃ 5 min。將100 μL鏈酶親和素標記的納米磁珠與PCR擴增所得的雙鏈DNA在常溫下孵育20 min，利用生物素與鏈酶親和素的親和作用，將雙鏈DNA結(jié)合到磁珠表面；將離心管放在磁性分離器上除去上清，用1 mL PBS洗滌磁珠；然后在離心管中加入200 μL NaOH (200 mmol/L)溶液，室溫反應(yīng)15 min，利用磁性分離器分離回收上清；用PCR純化回收試劑盒回收上清液中的正向ssDNA單鏈核酸，收集到含有ssDNA文庫的溶液用于下一輪的篩選。為提高篩選得到的ssDNA文庫的特異性和親和力，在隨后的篩選中，逐步縮短文庫與哈維氏弧菌的結(jié)合時間，同時減少哈維氏弧菌和ssDNA文庫的使用量，增加PBS緩沖液清洗靶標細胞的次數(shù)。

1.2.3 核酸適配體的序列分析

對最終獲得的核酸適配體庫進行克隆、測序，確定各適配體的DNA序列。具體操作如下：將最終得到的核酸適配體庫經(jīng)PCR擴增成dsDNA；切膠純化后連接到pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中；菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基(氨芐抗性)上，倒置在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；挑取100個單菌落并交由基因公司測序分析，得到核酸適配體序列。使用MFOLD(http://mfold.rna.albany.edu/?q=Mfold/DNA-Folding-Form)在線預(yù)測篩選得到核酸適配體的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 核酸適配體識別結(jié)合哈維氏弧菌的特異性分析

使用流式細胞術(shù)分析核酸適配體與哈維氏弧菌的特異性結(jié)合。本研究中使用FAM對核酸適配體進行標記，羥基熒光素激發(fā)波長為495 nm，發(fā)射波長為535 nm。將FAM標記的核酸適配體與哈維氏弧菌孵育結(jié)合，然后使用流式細胞儀進行熒光分析。在相應(yīng)波長范圍內(nèi)檢測熒光信號，根據(jù)信號強弱判斷核酸適配體與哈維氏弧菌的特異性識別結(jié)合情況。具體操作如下：FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)經(jīng)過92℃恒溫水浴變性、冰浴復(fù)性處理，然后與哈維氏弧菌4℃結(jié)合1 h，孵育結(jié)束后離心重復(fù)清洗3次，并混勻在500 μL PBS中，使用流式細胞儀進行熒光檢測。對照組共4組，對照組1 (Con1)是FAM標記的非特異性起始庫(200 nmol/L)和哈維氏弧菌的孵育結(jié)合；對照組2 (Con2)是FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)和溶藻弧菌的孵育結(jié)合；對照組3 (Con3)是FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)和嗜水氣單胞菌的孵育結(jié)合；對照組4 (Con4)是FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)和維氏氣單胞菌的孵育結(jié)合。每個反應(yīng)均做3個重復(fù)。

1.2.5 核酸適配體的細胞毒性分析

在96孔板中接入石斑魚脾臟細胞(Grouper spleen cell line,GS)，28℃培養(yǎng)18 h。然后將核酸適配體在細胞培養(yǎng)基中稀釋至不同濃度(0,100,500,1 000 nmol/L)。將不同濃度的核酸適配體分別與GS細胞于28℃條件下孵育48 h，對細胞進行光鏡觀察、拍照。然后在各孔中加入10 μL CCK-8溶液，室溫孵育4 h后，利用酶標儀檢測450 nm的吸光值來檢測細胞活性，以未與核酸適配體孵育的正常GS細胞作為對照組，做3個平行實驗。將測得的吸光值代入如下公式(1)，計算各組的細胞存活率(Survival Rate,SR)[19]：

SR (%) =OD450(實驗組)/OD450(對照組)×100%。

(1)

1.2.6 核酸適配體的靶標性質(zhì)分析

將哈維氏弧菌用胰酶消化處理10 min，離心并使用500 μL PBS重復(fù)清洗3次，然后與FAM標記的核酸適配體(200 nmol/L)在4℃孵育1 h，然后離心重復(fù)清洗3次，并混勻在500 μL PBS中，使用流式細胞儀進行熒光檢測，該組為實驗組(Test)。對照組為FAM標記的200 nmol/L核酸適配體(Con)與未經(jīng)胰酶消化處理的哈維氏弧菌孵育結(jié)合。每個反應(yīng)均做3個重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

應(yīng)用Excel 2010及SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計，采用非參數(shù)T檢驗及卡方檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SELEX技術(shù)篩選哈維氏弧菌的特異性核酸適配體

隨著篩選輪數(shù)(共10輪)增加，ssDNA文庫的特異性逐步升高(圖1)，其中，第9輪的ssDNA文庫對哈維氏弧菌的特異性結(jié)合豐度最高。因此對第10輪的ssDNA文庫進行克隆測序，得到2條核酸適配體H10和H13 (表1)。

Con表示FAM標記的隨機單鏈核酸ssDNA文庫與哈維氏弧菌的結(jié)合；**P<0.01表示差異極顯著,NS表示無顯著性差異

表1 核酸適配體的核苷酸序列

2.2 核酸適配體H10和H13的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與分析

核酸適配體H10和H13的二級結(jié)構(gòu)均能夠形成獨特復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖2)，且H10的吉布斯自由能(ΔG=-32.4 KJ/mol)低于H13 (ΔG=-14.46 KJ/mol)，表明H10的結(jié)構(gòu)比H13穩(wěn)定。

圖2 核酸適配體H10和H13的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 核酸適配體H10和H13的特異性分析

使用流式細胞術(shù)對篩選獲得的核酸適配體H10和H13的特異性進行檢測(圖3)，結(jié)果顯示，實驗組中哈維氏弧菌分別與核酸適配體H10和H13孵育后所檢測到的熒光值高，并顯著高于4組對照組(Con1、Con2、Con3、Con4)，表明核酸適配體H10和H13能夠高特異性識別結(jié)合哈維氏弧菌。

Con1、Con2、Con3和Con4表示FAM標記的非特異性起始庫(200 nmol/L)分別與哈維氏弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌的孵育結(jié)合; **P<0.01表示差異極顯著

2.4 核酸適配體H10和H13的細胞毒性分析

核酸適配體H10和H13的細胞毒性光鏡觀察結(jié)果顯示(圖4)，不同濃度的核酸適配體與細胞孵育48 h后，與對照組(0 nmol/L)相比，細胞形態(tài)正常，無明顯病變。當核酸適配體H10和H13的濃度為1 000 nmol/L時，實驗組細胞的存活率均高于99%，并且實驗組細胞存活率與對照組細胞無顯著性差異(圖5)，表明核酸適配體H10、H13無明顯的細胞毒性，這與此前報道核酸適配體無細胞毒性的研究結(jié)果一致[10,13,16,19]。

圖4 不同濃度的核酸適配體孵育細胞后的光鏡結(jié)果

NS表示組間差異不顯著

2.5 核酸適配體H10和H13的靶標性質(zhì)分析

與對照組相比，實驗組中胰酶消化處理后哈維氏弧菌的熒光值均顯著降低(圖6)，表明核酸適配體H10和H13對哈維氏弧菌表面的靶位點均為膜蛋白或膜蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)。

Con表示FAM標記的非特異性起始庫(200 nmol/L)和哈維氏弧菌的孵育結(jié)合；**P<0.01表示差異極顯著

3 討論

哈維氏弧菌是危害卵形鯧鲹、石斑魚、對蝦等大宗海水養(yǎng)殖動物的主要弧菌病原之一，其所導(dǎo)致的疾病具有高發(fā)、頻發(fā)、死亡率高等特點，嚴重危害著我國海水養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[1-4,17]。而針對哈維氏弧菌的快速檢測診斷技術(shù)和抑菌技術(shù)等進行系統(tǒng)研究，并開發(fā)出具有市場發(fā)展?jié)摿Φ目焖贆z測試劑盒和抗病害功能產(chǎn)品，將有助于高效控制海水養(yǎng)殖中哈維氏弧菌的危害。

目前，已報道了一些針對水生病原微生物的特異性核酸適配體[11]，包括溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)[20-22]，創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)[23]，沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)[24]，卵形鯧鲹源神經(jīng)壞死病毒(Trachinotusovatusnervous necrosis virus)[25]，病毒性出血性敗血癥病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus)[26]，中華鱉虹彩病毒(Soft-shelled turtle iridovirus)[14]，赤點石斑魚神經(jīng)壞死癥病毒(Red spotted grouper nervous necrosis virus)[27,28]，牙鲆彈狀病毒(hirame rhabdovirus)[29]，石斑魚虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus)[16,19]，草魚呼腸孤病毒(Salmonellatyphimurium)[30,31]等。當前，SELEX技術(shù)尚未實現(xiàn)自動化和標準化，因此將不同物質(zhì)作為靶標進行核酸適配體的篩選時，由于靶物質(zhì)大小、性質(zhì)等諸多差異，造成所需的SELEX技術(shù)篩選輪數(shù)和參數(shù)均顯著不同，這就使得篩選高特異性識別靶物質(zhì)的核酸適配體的難度顯著提升。例如，Liang等[22]經(jīng)過多達35輪的反復(fù)篩選，最終獲得高特異性識別狂犬病病毒感染細胞的核酸適配體，而Yu等[16]僅通過11輪的SELEX篩選就獲得了特異性識別石斑魚虹彩病毒的核酸適配體。在本研究中，以哈維氏弧菌活菌為靶標進行核酸適配體的篩選，綜合運用SELEX技術(shù)、磁性分離技術(shù)、流式細胞術(shù)等，經(jīng)過9輪篩選獲得能夠高特異性、高親和性識別哈維氏弧菌活菌的兩條ssDNA核酸適配體H10和H13，隨后二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析表明H10和H13均能夠形成獨特復(fù)雜的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而且核酸適配體H10和H13對哈維氏弧菌均具有較好的特異性結(jié)合能力(圖3)，并且對細胞無毒副作用(圖4)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，核酸適配體H10和H13對哈維氏弧菌表面的靶位點均為膜蛋白或膜蛋白相關(guān)結(jié)構(gòu)(圖6)。據(jù)報道，核酸適配體能夠在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過氫鍵、G四聯(lián)體、范德華力、疏水作用力、堿基堆積等折疊形成更復(fù)雜的三級結(jié)構(gòu)，進而與靶物質(zhì)發(fā)生特異性識別和結(jié)合[11]。目前，大規(guī)模應(yīng)用核酸適配體的限制條件之一是合成成本較高。然而，考慮到原代核酸適配體中兩端的引物序列等核苷酸序列或結(jié)構(gòu)域?qū)τ谄涮禺愋允潜匦璧模虼嗽谖磥硌芯恐?，有必要對核酸適配體的高特異性識別靶物質(zhì)的核苷酸序列等必需序列進行分析鑒定，這對于優(yōu)化核酸適配體結(jié)構(gòu)、降低其合成成本、研發(fā)基于核酸適配體的市場化功能產(chǎn)品具有重要意義[32]。

核酸適配體作為新型的核酸分子探針，具有特異性高、親和性強、無免疫原性、穩(wěn)定性高、高溫導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)變性具有可逆性、易于合成和化學修飾、批次間質(zhì)量穩(wěn)定等諸多優(yōu)點，因此核酸適配體已成為廣受關(guān)注的新型檢測和治療工具，并廣泛應(yīng)用于病原檢測、疾病診斷、靶向藥物開發(fā)和細胞功能分析等生命科學各領(lǐng)域的研究中[11,33-37]。例如，利用核酸適配體能夠高特異性識別病原微生物的特性，構(gòu)建高靈敏的檢測技術(shù)，用于病原快速檢測和疾病精確診斷[11]。Li等[38]利用高特異性識別結(jié)合石斑魚虹彩病毒感染細胞的核酸適配體Q3構(gòu)建出新型的酶聯(lián)核酸適配體吸附檢測技術(shù)(Aptamer-based Enzyme-Linked Apta-Sorbent Assay,ELASA)，成功檢測出樣品中石斑魚虹彩病毒，靈敏度可媲美PCR技術(shù)。Yu等[39]利用特異性識別溶藻弧菌的核酸適配體VA2構(gòu)建了VA2-ELASA技術(shù)，該技術(shù)可用于致病性溶藻弧菌的快速檢測，具有特異性強、靈敏度高的特點。Zhou等[40]以石斑魚神經(jīng)壞死病毒的衣殼蛋白(Coat Protein,CP)為靶標，篩選獲得特異性識別CP蛋白的核酸適配體A10，并建立了適配體-衣殼蛋白-適配體的“三明治”夾心酶聯(lián)吸附檢測技術(shù)，能夠用于魚類神經(jīng)壞死病毒的精確快速檢測。余慶等[41]利用核酸適配體Q5構(gòu)建出核酸適配體Q5熒光分子檢測探針(Aptamer Q5-based fluorescent molecular probe,Q5-AFMP)，并證實Q5-AFMP能夠高特異性、高靈敏性識別石斑魚虹彩病毒，有望開發(fā)出實用的病毒快速檢測功能產(chǎn)品。此外，基于核酸適配體開發(fā)的高靈敏生物傳感器，已成功應(yīng)用于金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌和沙門氏菌等多種致病菌的快速精確檢測[34]?；诒狙芯亢Y選得到核酸適配體H10和H13，具有高特異性和高親和性識別結(jié)合哈維氏弧菌的特性，因此，未來可利用核酸適配體H10和H13開展哈維氏弧菌快速檢測診斷技術(shù)的研究，以期實現(xiàn)對哈維氏弧菌病的快速診斷、實時監(jiān)控和有效預(yù)防。

4 結(jié)論

本研究以重要的水生病原哈維氏弧菌為靶標，運用SELEX技術(shù)篩選獲得ssDNA核酸適配體H10和H13，這兩種核酸適配體在識別哈維氏弧菌過程中顯現(xiàn)出高特異性、高親和性，并且細胞無毒性等優(yōu)點。該成果有望用于構(gòu)建成本低、快速便捷、靈敏度高的哈維氏弧菌檢測技術(shù)，并在水生病原快速檢測技術(shù)研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。