吳曉松，王 玲，吳紅梅，徐宇馨，范晶晶，徐 燕，梁睿貞

(1. 江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009； 2. 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)腸道病原微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210009； 3. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院護(hù)理部，江蘇 南京 210029； 4. 江蘇省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029； 5. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔內(nèi)科教研室，江蘇 南京 210029)

牙科綜合治療臺(tái)使用水來(lái)冷卻高速旋轉(zhuǎn)的牙科手機(jī)和沖洗牙齒表面，并在牙科治療期間為患者提供漱口水?；ミB的牙科綜合治療臺(tái)水路系統(tǒng)(dental unit waterlines, DUWLs)組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)向這些器械供水。由于牙科手機(jī)在停轉(zhuǎn)瞬間的“回吸效應(yīng)”和來(lái)自公共供水系統(tǒng)中定植的微生物，DUWLs普遍存在嚴(yán)重的微生物污染，是牙科交叉感染的重要危險(xiǎn)因素，曾有患者因于牙科就診感染水路中的軍團(tuán)菌而死亡[1]，DUWLs中的微生物也可能對(duì)老年人與免疫缺陷的患者造成嚴(yán)重威脅[2]。

DUWLs中微生物種類繁多，存在形式以生物膜和浮游菌兩種為主，研究[3]表明，銅綠假單胞菌、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸埃希菌、阿米巴原蟲(chóng)、真菌、分枝桿菌等都可以在DUWLs被發(fā)現(xiàn)。雖然大部分是條件致病菌，但由于牙科診療操作存在血液、唾液和氣溶膠傳播的風(fēng)險(xiǎn)，因此，如何控制DUWLs中的微生物，成為牙科診療消毒和感染控制的重點(diǎn)。

化學(xué)消毒法是目前對(duì)DUWLs微生物污染進(jìn)行消毒與感染控制的主要方法，有報(bào)道[4]采用低濃度的化學(xué)消毒劑如含氯消毒劑(如次氯酸鈉)、醋酸氯己定等周期性或持續(xù)性對(duì)DUWLs進(jìn)行消毒處理，可以有效殺滅DUWLs中的浮游菌，去除生物膜。但在水路中長(zhǎng)期使用低濃度的消毒劑對(duì)DUWLs會(huì)有何影響，是否會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)消毒劑的敏感性下降，甚至誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生抗性而導(dǎo)致消毒失敗尚缺乏相關(guān)研究。本研究對(duì)定期消毒的DUWLs進(jìn)行污染微生物種類分析，通過(guò)最低抑/殺菌濃度和消毒劑殺滅效果等試驗(yàn)觀測(cè)分離優(yōu)勢(shì)菌對(duì)常用水路消毒劑的抗性，為臨床規(guī)范和安全使用水路消毒劑提供數(shù)據(jù)支持，為進(jìn)一步加強(qiáng)牙科消毒與感染控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本與材料 試驗(yàn)對(duì)象為江蘇省某三級(jí)甲等口腔?？漆t(yī)院綜合科使用中牙科綜合治療臺(tái)。污染微生物標(biāo)本來(lái)自該院綜合科24臺(tái)同品牌同使用年限的牙科綜合治療臺(tái)(2011年購(gòu)置)，該批次牙科綜合治療臺(tái)消毒頻次為每2周一次，消毒劑為含氯消毒劑，使用濃度為有效氯500 mg/L。

標(biāo)準(zhǔn)菌株為龜分枝桿菌膿腫亞種 ATCC 93326(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京)。

1.2 儀器與試劑 飛行質(zhì)譜鑒定儀(VITEK Mass Spectrometry)購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司，恒溫水浴箱購(gòu)自美國(guó)PolyScience公司，恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Incucell MMM，微生物集菌儀(HTY-601)購(gòu)自杭州泰林生物技術(shù)設(shè)備有限公司。

醋酸氯己定(AR)為德國(guó)SIGMA公司產(chǎn)品，84消毒劑為江蘇愛(ài)特福股份有限公司產(chǎn)品，過(guò)氧乙酸消毒劑為南京化學(xué)試劑股份有限公司產(chǎn)品，過(guò)氧化氫消毒劑為南京化學(xué)試劑股份有限公司產(chǎn)品，牛血清白蛋白(BSA)為美國(guó)AMRESCO公司產(chǎn)品，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基及相關(guān)試劑均為國(guó)內(nèi)市售產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集 于試驗(yàn)當(dāng)日開(kāi)診前半小時(shí)采集24臺(tái)牙科綜合治療臺(tái)高速手機(jī)出水口處的水10 mL，連續(xù)采集2份標(biāo)本，采集前先踩手機(jī)腳踏控制板，空轉(zhuǎn)30 s沖洗水管后進(jìn)行采樣，同時(shí)取該牙科綜合治療臺(tái)對(duì)應(yīng)的自來(lái)水10 mL作為陰性對(duì)照組。

1.3.2 細(xì)菌計(jì)數(shù)及鑒定 將出水口每個(gè)標(biāo)本各取1.0 mL、100 μL分別涂布普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板和銅綠假單胞菌選擇性平板，35℃培養(yǎng)48 h，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)和銅綠假單胞菌選擇性培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上的菌落挑取單個(gè)菌落進(jìn)行四區(qū)劃線并純化，剩余標(biāo)本使用微生物集菌儀進(jìn)行貼膜培養(yǎng)，并挑取單個(gè)菌落進(jìn)行四區(qū)劃線并純化。陰性對(duì)照組采用同樣方法進(jìn)行試驗(yàn)。挑取平皿四區(qū)中的典型菌落，均勻涂在靶板的定位孔內(nèi)，再加1 μL基質(zhì)液，以16孔為一個(gè)區(qū)域，在中心孔涂布標(biāo)準(zhǔn)菌株。輸入靶板號(hào)，進(jìn)入飛行質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。

1.3.3 病原菌對(duì)消毒劑抗力測(cè)定 將DUWLs分離的優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)黏液分枝桿菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株龜分枝桿菌膿腫亞種分別接種Middlebrook 7H10瓊脂斜面，取37℃培養(yǎng)48 h新鮮培養(yǎng)物，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗下菌苔并稀釋配制成菌懸液備用。采用肉湯稀釋法，測(cè)定各試驗(yàn)菌對(duì)消毒劑最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)，MIC和MBC試驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4 懸液定量殺菌試驗(yàn) 在20℃試驗(yàn)條件下將含3%牛血清白蛋白的菌懸液與消毒劑混合作用一定時(shí)間，取混合液至中和劑中，中和作用10 min，取0.1 mL涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，同時(shí)用TPS稀釋液代替消毒劑進(jìn)行平行試驗(yàn)，作為陽(yáng)性對(duì)照。計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值，試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 DUWLs中的細(xì)菌含量和微生物檢測(cè)結(jié)果 24臺(tái)DUWLs的48個(gè)標(biāo)本菌落檢出率100.00%，平均菌落數(shù)(2.25±1.43)×105CFU/mL，對(duì)照組24個(gè)自來(lái)水標(biāo)本平均菌落數(shù)為(38.21±1.86)CFU/mL，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)鑒定，24臺(tái)DUWLs中共檢出9種污染微生物，其中產(chǎn)黏液分枝桿菌占比(35.72%)最高，未檢出銅綠假單胞菌和軍團(tuán)菌。見(jiàn)表1。

表1 24臺(tái)DUWLs檢出微生物及分布

2.2 優(yōu)勢(shì)菌對(duì)常見(jiàn)消毒劑抗力測(cè)定結(jié)果 經(jīng)鑒定試驗(yàn)證明，采用5 g/L硫代硫酸鈉+20 g/L吐溫80+3 g/L卵磷脂肉湯能有效中和醋酸氯己定殘留毒性；5 g/L硫代硫酸鈉+5 g/L吐溫80肉湯能有效中和次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸、過(guò)氧化氫三種消毒劑的殘留毒性。醋酸氯己定、次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸、過(guò)氧化氫對(duì)10株優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)黏液分枝桿菌的MIC均分別為1.5、500、5、100 mg/L，4種消毒劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC分別為6、700、25、1 000 mg/L；4種消毒劑對(duì)10株優(yōu)勢(shì)菌產(chǎn)黏液分枝桿菌的MBC均分別為3、500、10、200 mg/L，4種消毒劑對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株的MBC分別為600、700、50、1 000 mg/L。4種常用消毒劑對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的MIC和MBC均低于標(biāo)準(zhǔn)菌株龜分枝桿菌膿腫亞種ATCC 93326。

2.3 不同消毒劑在不同作用時(shí)間對(duì)優(yōu)勢(shì)菌的殺滅效果 由于分離的10株產(chǎn)黏液分枝桿菌對(duì)4種消毒劑的MIC與MBC一致，選擇1號(hào)菌株進(jìn)一步進(jìn)行不同消毒劑對(duì)其的殺滅效果試驗(yàn)。結(jié)果顯示：0.5%醋酸氯己定在作用30 min時(shí)對(duì)試驗(yàn)菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的平均殺滅對(duì)數(shù)值均<4.00，未達(dá)到消毒要求；0.1%次氯酸鈉作用10 min，對(duì)分離優(yōu)勢(shì)菌的殺滅對(duì)數(shù)值>4.00，作用20 min對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株龜分枝桿菌膿腫亞種的殺滅對(duì)數(shù)值>4.00，達(dá)到消毒要求； 0.1%過(guò)氧乙酸作用10 min，對(duì)分離優(yōu)勢(shì)菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株龜分枝桿菌膿腫亞種的殺滅對(duì)數(shù)值均>4.00，達(dá)到消毒要求；3%過(guò)氧化氫作用30 min，對(duì)分離優(yōu)勢(shì)菌和標(biāo)準(zhǔn)菌株龜分枝桿菌膿腫亞種的殺滅對(duì)數(shù)值均>4.00，達(dá)到消毒要求。見(jiàn)表2。

表2 4種常用消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株不同作用時(shí)間的殺滅對(duì)數(shù)值

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，該醫(yī)院DUWLs被大量的微生物污染，數(shù)量級(jí)達(dá)到105，細(xì)菌來(lái)自水路中浮游菌和生物膜，與以往的研究[5]相近。通過(guò)質(zhì)譜分析儀進(jìn)一步分析菌群的構(gòu)成，共分離9種微生物，其中產(chǎn)黏液分枝桿菌占比最高，達(dá)35.72%，其次為真菌，占21.43%，另有少量的艱難梭菌、螯肢分枝桿菌等，但未檢出銅綠假單胞菌和軍團(tuán)菌。此結(jié)果與Barbeau等[6]報(bào)道DUWLs中銅綠假單胞菌的檢出率達(dá)24%存在差異，也使本研究利用銅綠假單胞菌篩選培養(yǎng)基對(duì)其主動(dòng)收集的研究設(shè)計(jì)未能得以體現(xiàn)，但與鮑容等[7]對(duì)醫(yī)院供水系統(tǒng)分枝桿菌污染的調(diào)查結(jié)果相近。分析其原因?yàn)樗废到y(tǒng)中細(xì)菌繁多，生態(tài)復(fù)雜，不同醫(yī)院不同科室的DUWLs中可能存有不同的細(xì)菌生態(tài)；其次更可能的原因是飲用水系統(tǒng)經(jīng)氯化處理后系統(tǒng)內(nèi)的菌落發(fā)生變化，非致病性分枝桿菌和鞘氨醇屬為菌落中的優(yōu)勢(shì)菌[8]，不同水源、不同條件下供水系統(tǒng)生物膜內(nèi)菌落的研究中，均檢測(cè)到分枝桿菌，某些情況下分枝桿菌為其主要菌落[9-11]。而該口腔醫(yī)院一直使用含氯消毒劑對(duì)DUWLs進(jìn)行定期消毒，由此可見(jiàn)，對(duì)DUWLs的消毒處置特別是使用含氯消毒劑可能是本研究中產(chǎn)黏液分枝桿菌成為優(yōu)勢(shì)菌的原因之一。

產(chǎn)黏液分枝桿菌屬于非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculosis mycobacteria， NTM)中的快速生長(zhǎng)分枝桿菌，可通過(guò)呼吸道、胃腸道、皮膚黏膜等途徑侵入人體，作為一種條件致病菌，通常情況下可在人體中保持平衡，多在機(jī)體抵抗力下降時(shí)發(fā)病，可導(dǎo)致淋巴結(jié)炎、慢性肺部疾病、創(chuàng)傷后皮膚感染和敗血癥等，與醫(yī)院感染密切相關(guān)[12]。近年來(lái)NTM的檢出率及其感染發(fā)病率不斷增高，有研究[13]報(bào)道南京地區(qū)NTM檢出率為15.5%，感染發(fā)病率為56.5%。墨西哥一所創(chuàng)傷醫(yī)院的飲用水標(biāo)本中NTM檢出率為52%，其中產(chǎn)黏液分枝桿菌占81%[14]，另有研究[15]報(bào)道產(chǎn)黏液分枝桿菌通過(guò)醫(yī)院供水系統(tǒng)，在患者淋浴時(shí)污染中央靜脈導(dǎo)管，導(dǎo)致患者菌血癥的暴發(fā)。本研究中的口腔診療多為有創(chuàng)操作，常需直接接觸患者的血液、唾液和口腔黏膜等，同時(shí)高速手機(jī)在運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)又需要不斷的供水冷卻，DUWLs的污染可導(dǎo)致交叉感染，因此，對(duì)DUWLs中分枝桿菌的高檢出率應(yīng)高度重視。

細(xì)菌對(duì)消毒劑的抗性是指出現(xiàn)對(duì)常用濃度的消毒劑不再敏感的菌株，普遍認(rèn)為廣泛或不合理使用消毒劑可產(chǎn)生篩選壓力[16]，若長(zhǎng)期使用亞致死濃度的消毒劑，則易導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)該濃度的消毒劑產(chǎn)生適應(yīng)效應(yīng)，最終演變?yōu)閷?duì)消毒劑的抵抗[17]。臨床流行的分枝桿菌對(duì)2%醋酸氯己定具有高度抗性[18]，本研究中雖然在MIC、MBC中未觀察到產(chǎn)黏液分枝桿菌對(duì)醋酸氯己定的抗性超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)菌株，但在懸液定量殺菌試驗(yàn)中，30 min內(nèi)常用濃度的醋酸氯己定并不能有效殺滅產(chǎn)黏液分枝桿菌，提示無(wú)論是在DUWLs中使用醋酸氯己定進(jìn)行消毒還是通過(guò)含漱液(含醋酸氯己定)預(yù)防控制患者口腔感染，都存在感染風(fēng)險(xiǎn)。另外通過(guò)對(duì)口腔診療中現(xiàn)行DUWLs消毒與感染控制措施的初步研究發(fā)現(xiàn)，水路中分離的產(chǎn)黏液分枝桿菌對(duì)高效消毒劑(含氯消毒劑、過(guò)氧化氫、過(guò)氧乙酸)的抗力也有部分發(fā)生變化，其對(duì)次氯酸鈉的MIC及MBC值均較高，接近標(biāo)準(zhǔn)菌株的抗力水平，提示使用的化學(xué)消毒法，已對(duì)本研究所選醫(yī)院DUWLs的污染微生物菌群產(chǎn)生影響，對(duì)含氯消毒劑抗力更強(qiáng)的NTM已取代銅綠假單胞菌與軍團(tuán)菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，因此在對(duì)本研究所選醫(yī)院DUWLs進(jìn)行化學(xué)消毒時(shí)應(yīng)特別注意消毒劑種類的選擇，濃度、頻率及操作的規(guī)范化。

本研究?jī)H對(duì)一所三級(jí)口腔專科醫(yī)院進(jìn)行研究，數(shù)據(jù)覆蓋面較小，在DUWLs中NTM是否因?yàn)橄痉绞降倪x擇而廣泛取代銅綠假單胞菌等傳統(tǒng)優(yōu)勢(shì)菌群還需要進(jìn)一步研究。