王藝曉， 張哲， 張靜瑜， 楊光， 王莉

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，治療以手術(shù)切除為主，同時(shí)輔以化療、放療、中醫(yī)藥治療等綜合治療手段[1]。CRC早期的臨床癥狀以便血、排便習(xí)慣改變?yōu)橹鳎Y狀較少且易被患者忽視，導(dǎo)致CRC的發(fā)病率及死亡率仍處于轉(zhuǎn)高水平[2-3]。有效的診斷標(biāo)志物與CRC早期診斷、疾病進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切。線粒體是為細(xì)胞提供能量的代謝性細(xì)胞器，其攜帶的線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)由于缺乏組蛋白的保護(hù)易發(fā)生突變，從而降低線粒體氧化能力，可能導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。同時(shí)mtDNA表達(dá)水平遠(yuǎn)高于核DNA，當(dāng)mtDNA表達(dá)水平發(fā)生改變時(shí)極易被檢測(cè)出來(lái)[5]。近年來(lái)有關(guān)mtDNA與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系的研究逐漸增多，但在mtDNA的表達(dá)對(duì)CRC診斷價(jià)值方面鮮有報(bào)道。本研究探討了外周血白細(xì)胞mtDNA水平與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系，并分析外周血白細(xì)胞mtDNA對(duì)CRC的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年5月至2020年5月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的CRC患者164例為研究對(duì)象，收集患者的臨床病理特征資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡22～80歲，預(yù)計(jì)生存時(shí)間不短于6個(gè)月；②經(jīng)病理活檢及病理組織學(xué)檢查首次確診為CRC；③無(wú)手術(shù)史、放化療史。④臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤或帕金森、亨廷頓病、母系遺傳性耳聾等線粒體疾病；②合并免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病或心、肝、腎功能?chē)?yán)重不足者；③術(shù)后復(fù)發(fā)者。另選擇同期體檢健康者160人為對(duì)照組。研究在實(shí)施前已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者對(duì)本次研究?jī)?nèi)容均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采集研究對(duì)象的清晨空腹外周肘靜脈血5 ml于EDTA抗凝真空管中，3 000 r/min離心10 min，以紅細(xì)胞裂解液裂解下層沉淀2～3次，5 min/次，3 000 r/min離心5 min，取下層白細(xì)胞沉淀，以1 ml紅細(xì)胞裂解液重懸后轉(zhuǎn)入EP管中，3 000 r/min離心5 min，棄上清，將白細(xì)胞以1 ml磷酸緩沖鹽溶液洗滌2～3次，2 000 r/min離心3 min，再將沉淀以150 μl磷酸緩沖鹽溶液重懸，分裝后凍存于-80 ℃冰箱備用。分別提取CRC組和對(duì)照組的基因組DNA，并嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說(shuō)明書(shū)操作，調(diào)整DNA濃度≥50 ng/μl，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外周血白細(xì)胞mtDNA水平的檢測(cè) 分別設(shè)計(jì)ND1基因和β-珠蛋白(β-globin)基因?yàn)閙tDNA和核DNA(nDNA)的參照基因(北京百奧萊博科技有限公司合成)。ND1基因正向引物序列：5′-CCATCGATCAGCTAATCATG-3′，反向引物序列：5′-TAGCATCAGCTCGTAGTCAT-3′，長(zhǎng)度為159 bp；β-globin基因正向引物序列：5′-CGTGACTGTCGACTAGCACT-3′，反向引物序列：5′-ATCGTCATCCGTGAACTCTA-3′，長(zhǎng)度為137 bp。以無(wú)菌去離子水10倍稀釋過(guò)的ND1和β-globin基因重組質(zhì)粒為模板行熒光定量PCR，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)設(shè)定反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性16 s，60 ℃退火50 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，收集熒光信號(hào)。PCR擴(kuò)增結(jié)果以Ct值表示，外周血白細(xì)胞mtDNA水平的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=Ct(mtDNA)-Ct(nDNA)。

1.2.3 可能影響CRC發(fā)生以及外周血白細(xì)胞mtDNA水平的臨床資料收集 收集CRC組與對(duì)照組臨床資料，包括年齡、性別、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、結(jié)腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎史、腫瘤家族史、腸道菌群占比、外周血白細(xì)胞mtDNA水平、TNM分期[6]、腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CRC患者外周血白細(xì)胞mtDNA水平與臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理特征分析顯示，腫瘤分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者外周血白細(xì)胞mtDNA水平低于腫瘤分化程度高、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)；不同年齡、性別、TNM分期、浸潤(rùn)程度的CRC患者外周血白細(xì)胞mtDNA水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 結(jié)直腸癌患者外周血白細(xì)胞mtDNA水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 可能影響CRC發(fā)生的相關(guān)因素比較

與對(duì)照組比較，CRC組結(jié)腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎史、腫瘤家族史及梭桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)腸道菌群占比更高(P<0.05)；CRC組外周血白細(xì)胞mtDNA水平低于對(duì)照組(P<0.05)；兩組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、糖尿病史比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 影響結(jié)直腸癌發(fā)生的相關(guān)因素比較

2.3 Logistic回歸分析CRC發(fā)生的危險(xiǎn)因素

將可能影響CRC發(fā)生的危險(xiǎn)因素設(shè)為自變量(X)，是否發(fā)生CRC設(shè)為因變量(Y)，對(duì)相關(guān)因素賦值，發(fā)生CRC記為1，未發(fā)生則為0，進(jìn)行Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，外周血白細(xì)胞mtDNA低表達(dá)、結(jié)腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎史、腫瘤家族史及梭桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)腸道菌群占經(jīng)高是影響CRC發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見(jiàn)表3～4。

表3 Logistic回歸分析法賦值

2.4 ROC曲線分析外周血白細(xì)胞mtDNA水平對(duì)CRC的診斷價(jià)值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，外周血白細(xì)胞mtDNA水平對(duì)CRC最佳截?cái)帱c(diǎn)為79.38，靈敏度為82.94%、特異度為75.83%、準(zhǔn)確度為80.56%、AUC為0.815，95%CI為0.654～0.981。見(jiàn)圖1。

表4 Logsitic回歸分析影響結(jié)直腸癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素

圖1 外周血白細(xì)胞mtDNA水平預(yù)測(cè)CRC發(fā)生的ROC曲線圖

3 討論

早期CRC患者的腸黏膜由于受到腫瘤的侵蝕而產(chǎn)生的異物性刺激，使患者排便次數(shù)以及糞便性質(zhì)發(fā)生改變，且這種直腸刺激癥狀發(fā)展較為緩慢[7]。便血是大多數(shù)患者唯一的早期癥狀，不易引起患者的重視，因此臨床上確診的CRC患者近一半已發(fā)展至晚期[8]。CRC晚期時(shí)癌腫增大并侵犯周?chē)M織器官，有時(shí)可致腸腔狹窄，出現(xiàn)腸梗阻征象，同時(shí)易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，極大地降低了患者生存率，因此對(duì)CRC進(jìn)行早期篩查、及時(shí)確診是降低發(fā)病率、提高治愈率的關(guān)鍵[9-10]。目前腸鏡檢測(cè)是常用的篩查方法，可結(jié)合大便隱血檢測(cè)提高準(zhǔn)確性，但腸鏡檢測(cè)具有侵入性，存在破壞癌細(xì)胞而引起癌癥惡化的風(fēng)險(xiǎn)，且便捷性差[11]。近幾年，越來(lái)越多的研究者嘗試將血檢用于CRC早期篩查和病情進(jìn)展評(píng)估，尋找新的基因標(biāo)志物成為了目前研究CRC的熱點(diǎn)。

mtDNA是存在于細(xì)胞線粒體內(nèi)的特殊形態(tài)的核糖核酸，其較核DNA更易受到活性氧的攻擊從而產(chǎn)生mtDNA氧化損傷，導(dǎo)致mtDNA序列及表達(dá)量的變異[12]。Hsu等[13]發(fā)現(xiàn)，多種實(shí)體瘤中存在mtDNA表達(dá)量的差異，這種差異引起的線粒體氧化磷酸化等功能障礙可能是腫瘤發(fā)生機(jī)制之一。不同類(lèi)型腫瘤組織中mtDNA表達(dá)量存在異質(zhì)性，如在CRC、乳腺癌、肺癌等組織中mtDNA表達(dá)量常呈減少的狀態(tài)，且在CRC患者組織中mtDNA表達(dá)量越低則腫瘤分化程度越低，患者預(yù)后較差[14-16]。王賁士等[17]將mtDNA表達(dá)水平與CRC局部浸潤(rùn)程度、淋巴轉(zhuǎn)移程度及臨床分期進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)低分化組mtDNA表達(dá)量低于中、高分化組。Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，外周血白細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)與CRC風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，mtDNA拷貝數(shù)或許可作為CRC風(fēng)險(xiǎn)的長(zhǎng)期預(yù)測(cè)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，腫瘤分化程度低、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者外周血白細(xì)胞mtDNA水平低于腫瘤分化程度高、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，這可能與氧化磷酸化蛋白的減少有關(guān)，提示外周血白細(xì)胞mtDNA水平可作為CRC患者病情嚴(yán)重程度評(píng)估的重要指標(biāo)。

聶泓宇等[19]對(duì)近十年CRC患者臨床資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有CRC家族史、超重的男性、糖尿病患者的CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高。Song等[20]研究發(fā)現(xiàn)，飲食、環(huán)境及腸道微生物組成與CRC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)。Lopez等[21]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎可對(duì)腸道產(chǎn)生慢性炎癥刺激且病程較長(zhǎng)，易導(dǎo)致增生性疾病和癌癥，潰瘍性結(jié)腸炎患者患CRC的風(fēng)險(xiǎn)大約是普通人群的2.4倍。本研究Logistic回歸分析顯示，外周血白細(xì)胞mtDNA水平、結(jié)腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎史、腫瘤家族史及梭桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)腸道菌群占比高是CRC發(fā)生的危險(xiǎn)因素，表明除結(jié)腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎史、腫瘤家族史及梭桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)腸道菌群等常規(guī)因素外，外周血白細(xì)胞mtDNA水平亦是影響CRC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。進(jìn)一步ROC分析顯示，外周血白細(xì)胞mtDNA水平對(duì)CRC的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、AUC分別為82.94%、75.83%、80.56%、0.815，提示外周血白細(xì)胞mtDNA水平對(duì)CRC有一定的診斷價(jià)值。

綜上所述，CRC患者外周血白細(xì)胞mtDNA水平降低，同時(shí)外周血白細(xì)胞mtDNA水平與CRC的發(fā)生及惡性程度有關(guān)，對(duì)CRC具有臨床診斷價(jià)值。