FAN Xing-yan， 于 莎， 汪 云， 匡延平

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院輔助生殖科，上海 200011

卵巢低儲(chǔ)備(diminished ovarian reserve, DOR)表現(xiàn)為卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱，卵子數(shù)量和質(zhì)量雙重下降[1]。研究表明[2]，約10%的育齡期婦女經(jīng)歷卵巢儲(chǔ)備功能下降而尋求不孕癥治療。目前輔助生殖技術(shù) (assisted reproductive technology，ART) 是DOR不孕癥患者最有效的治療方式。促排卵是ART治療的首要步驟，但DOR患者在接受傳統(tǒng)促排卵方案中，表現(xiàn)為對(duì)外源性促性腺激素 (gonadotropin, Gn) 刺激反應(yīng)低下，周期取消率升高，獲卵數(shù)、可用胚胎數(shù)減少及妊娠率低下[3-5]。因此，選擇合適的促排卵方案是DOR患者接受ART治療首要考慮的問(wèn)題。

枸櫞酸氯米芬 (clomiphene citrate, CC，克羅米芬)為雌激素受體拮抗劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合下丘腦細(xì)胞內(nèi)的雌激素受體，刺激促卵泡生成素 (follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH) 和促黃體生成素 (luteinizing hormone, LH)的分泌，從而使卵巢內(nèi)的卵泡生長(zhǎng)、發(fā)育[6]。Teramoto等[7]的研究發(fā)現(xiàn)CC微刺激方案可以使年齡高達(dá)45歲的婦女在1個(gè)取卵周期至少獲得1枚成熟卵子，提高了DOR患者的治療效率。然而在DOR患者中使用CC微刺激方案促排卵常會(huì)引起早發(fā)LH峰的出現(xiàn)，導(dǎo)致提前排卵，降低促排卵效率[8]。

高孕激素促排卵方案 (progestin-primed ovarian stimulation, PPOS) 是基于全胚冷凍的治療策略，利用孕激素(外源性或內(nèi)源性)的負(fù)反饋機(jī)制阻止促排卵過(guò)程中早發(fā)LH峰的出現(xiàn)[9-13]?；诼殉驳头磻?yīng)患者的研究[14]發(fā)現(xiàn)，PPOS方案較自然周期能有效地抑制過(guò)早LH峰的發(fā)生及提前排卵，卵泡生長(zhǎng)時(shí)間更長(zhǎng)，且取卵前卵泡的直徑更大，可控性增加；實(shí)驗(yàn)室結(jié)局顯示PPOS方案組的獲卵數(shù)和有效胚胎數(shù)較自然周期明顯增多，但妊娠結(jié)局兩組無(wú)差異。

因此，本研究進(jìn)一步回顧性分析近10年我中心應(yīng)用PPOS方案與CC微刺激方案治療DOR患者的取卵周期結(jié)局及內(nèi)分泌變化特點(diǎn)，以進(jìn)一步證實(shí)PPOS方案在DOR患者促排卵周期中的可控性，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 回顧性分析2011年1月至2020年12月因DOR就診于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，接受體外受精-胚胎移植 (invitrofertilization-embryo transfer, IVF-ET) 治療的不孕癥患者。

納入標(biāo)準(zhǔn)[14]：符合不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)，即夫妻雙方正常性生活，未避孕1年未孕；年齡25～45歲；雙側(cè)卵巢的基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(antral follicle count，AFC)少于 5枚；基礎(chǔ)FSH 10～30 U/L; 抗苗勒管激素 (anti-Müllerian hormone, AMH) < 1.1 ng/mL；規(guī)律自發(fā)的月經(jīng)周期21～35 d。排除標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)第3天的雌激素(estrogen,E2)>70 pg/mL；染色體異常，生殖器官畸形和生殖系統(tǒng)腫瘤；患有其他全身性的急慢性疾病。

1.2 促排卵方案 PPOS方案：從月經(jīng)第3天起口服醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate, MPA, 浙江仙琚制藥，2 mg/粒)10 mg，或MPA 10 mg+乙炔雌二醇(ethinyl estradiol，EE，信宜制藥，12.5 μg/粒)12.5～25 μg。用藥5～7 d后復(fù)診，當(dāng)卵泡開(kāi)始生長(zhǎng)，同時(shí)伴隨E2的上升，且FSH<8.0 U/L時(shí)，給予小劑量人尿促性素(human menopausal gonadotropin, hMG；上海麗珠制藥有限公司，75 U/支) 75～150 U促進(jìn)卵泡發(fā)育。之后每隔2～4 d進(jìn)行1次經(jīng)陰道超聲檢查以記錄發(fā)育卵泡大小及數(shù)量，并同時(shí)測(cè)定血清FSH、LH、E2及孕激素(progesterone, P) 濃度，根據(jù)卵巢反應(yīng)情況調(diào)整hMG用量。當(dāng)主卵泡直徑≥18 mm時(shí)，同時(shí)停用MPA和hMG，注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG，麗珠醫(yī)藥)1 000 U和短效促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRH-a，達(dá)必佳，德國(guó)輝凌)0.1 mg共同誘發(fā)排卵。

CC微刺激促排卵方案：從月經(jīng)第3天起口服CC(塞浦路斯高特制藥,50 mg/粒) 50 mg/d; 3～5 d后復(fù)診，進(jìn)行經(jīng)陰道超聲檢查以記錄發(fā)育卵泡大小及數(shù)量，并同時(shí)測(cè)定血清FSH、LH、E2、P的濃度。若有1個(gè)卵泡的直徑大于13 mm，或血清LH較基礎(chǔ)值升高1倍以上時(shí)，加注促性腺激素釋放激素拮抗劑(gonadotropin-releasing hormone antagonist，GnRH-anti，思則凱，默克雪蘭諾； 0.25 mg/支) 0.125～0.25 mg。根據(jù)卵巢反應(yīng)情況決定是否需要注射hMG (75～150 U) 隔日1次。當(dāng)主卵泡直徑≥18 mm時(shí)，注射GnRH-a 0.1 mg誘發(fā)排卵。

1.3 取卵及胚胎評(píng)估 常規(guī)在誘發(fā)排卵后34～36 h經(jīng)陰道穿刺取卵。有早發(fā)LH峰的出現(xiàn)(LH>20 U/L)時(shí)，則于出峰后18～30 h取卵[14]。取卵后

按常規(guī)進(jìn)行IVF或卵泡漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，胚胎評(píng)級(jí)按本中心標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估。

根據(jù)胚胎原核評(píng)分、發(fā)育速度及形態(tài)學(xué)等參數(shù)，卵裂球的大小、形態(tài)、數(shù)目、胞質(zhì)情況、碎片的比例進(jìn)行質(zhì)量評(píng)分，分為4級(jí)[15]。Ⅰ級(jí)：胚胎卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則且胞質(zhì)均勻清晰，碎片無(wú)或少于10%；Ⅱ級(jí)：胚胎卵裂球不等，且形態(tài)欠規(guī)則, 碎片10%～25%；Ⅲ級(jí)：胚胎卵裂球大小不均等，碎片25%～50%；Ⅳ級(jí)：胚胎卵裂球大小嚴(yán)重不均，碎片大于50%。Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍保存，剩余未達(dá)到優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)的胚胎予以繼續(xù)培養(yǎng)，至囊胚形成后冷凍。

1.4 觀察及評(píng)價(jià)指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)為早發(fā)LH峰比例，次要觀察指標(biāo)包括獲卵數(shù)(率)、成熟卵數(shù)(率)、受精卵數(shù)(率)、卵裂數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)、有效胚胎數(shù)、促排卵過(guò)程中的Gn 用量及用藥時(shí)間和激素水平變化等。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用RStudio (version 1.3.1093) 建立傾向評(píng)分匹配(propensity score matching, PSM)模型，平衡兩組基線特征的差異。選擇11個(gè)協(xié)變量通過(guò)logistic回歸來(lái)估計(jì)傾向評(píng)分，包括年齡、不孕年限、既往移植失敗次數(shù)、既往無(wú)可用胚胎周期次數(shù)、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)及AFC、AMH、FSH、LH、E2、P的基礎(chǔ)水平。兩組患者采用最近鄰隨機(jī)匹配算法，比例為1∶1。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者的一般資料 共納入1 827例DOR不孕癥患者，匹配后共972例患者，每組486例。結(jié)果(表1)表明：兩組患者的年齡、不孕年限、既往移植失敗周期及無(wú)可用胚胎周期次數(shù)、BMI、AMH、AFC以及基礎(chǔ)激素水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組患者基線資料的對(duì)比 N=486

2.2 兩組患者促排卵結(jié)局 結(jié)果(表2)表明：治療周期結(jié)束后，PPOS組的hMG應(yīng)用天數(shù)及劑量明顯多于CC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001)。但CC組中早發(fā)LH峰比例(39.92%)顯著高于PPOS組(6.17%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.001)，且其誘發(fā)排卵至取卵時(shí)間較PPOS組明顯縮短P<0.001)。

表2 兩組患者匹配后促排卵結(jié)局對(duì)比 N=486

2.3 兩組患者促排卵周期中內(nèi)分泌激素水平的動(dòng)態(tài)變化 結(jié)果(圖1)表明：PPOS組與CC組患者基礎(chǔ)FSH均高于10 U/L[(13.16±2.86) U/Lvs(13.27±3.42) U/L]。促排卵過(guò)程中，PPOS組FSH (D3: 13.16 U/L; D 5～6: 11.94 U/L; D8～9: 11.77 U/L)和LH[D3: (4.33±1.90) U/L；D5～6: (5.12±2.76) U/L；D8～9: (4.79±9.07) U/L]水平呈現(xiàn)平穩(wěn)狀態(tài)。而在CC組中，隨著促排卵時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)SH和LH均呈明顯升高趨勢(shì)，特別是LH水平，在促排卵后期較基礎(chǔ)水平明顯升高(38.01 U/Lvs4.33 U/L,P<0.001)。與FSH和LH相應(yīng)，CC組患者E2及P水平也較PPOS組偏高(P<0.001)。

圖1 促排卵過(guò)程中各時(shí)間點(diǎn)激素變化***P<0.001

2.4 兩組患者的胚胎實(shí)驗(yàn)室結(jié)局 結(jié)果(表3)表明：兩組患者獲卵數(shù)(率)、成熟卵數(shù)、正常受精卵數(shù)(率)、卵裂數(shù)、有效胚胎數(shù)及卵子利用率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但PPOS方案組患者成熟卵率明顯高于CC組(0.87±0.29vs0.78±0.35,P<0.001)，可能與PPOS方案相對(duì)容易控制取卵時(shí)間相關(guān)。

表3 兩組患者胚胎實(shí)驗(yàn)室結(jié)局

3 討 論

本研究回顧性分析了PPOS方案與CC微刺激方案在DOR患者接受IVF-ET治療中的取卵周期結(jié)局。DOR患者的卵泡池中原始卵泡及對(duì)FSH敏感的卵泡已明顯減少，生殖激素顯示早卵泡期的FSH水平較高，振幅過(guò)大，LH持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，E2和P水平下降，與絕經(jīng)過(guò)渡期描述的情況相似[16-17]。前期研究[14]顯示，卵巢低反應(yīng)患者易出現(xiàn)早發(fā)LH峰，而采用P后，此現(xiàn)象可以得到有效控制。本研究顯示PPOS方案在用藥初期，LH呈輕度上升趨勢(shì)[D3: (4.33±1.90) U/L；D5～6: (5.12±2.76) U/L]，這與p作用時(shí)間尚短，其負(fù)反饋?zhàn)饔蒙形赐耆l(fā)揮相關(guān)。隨著P使用時(shí)間的延長(zhǎng)，其負(fù)反饋?zhàn)饔弥饾u發(fā)揮，LH水平降低(P<0.001)。而在促排卵后期，CC組患者LH水平則較基礎(chǔ)水平明顯升高。在對(duì)早發(fā)LH峰的統(tǒng)計(jì)中發(fā)現(xiàn)，PPOS組中有30例患者出現(xiàn)早發(fā)LH峰，而CC微刺激組中則有194例患者出現(xiàn)了早發(fā)LH峰 (6.17%vs39.92%,P<0.001)。因此，PPOS方案中誘發(fā)排卵至取卵時(shí)間較CC組相對(duì)容易控制，且其更容易獲得相對(duì)高的成熟卵率。這些結(jié)果提示DOR患者在促排卵過(guò)程中使用PPOS方案能有效抑制早發(fā)LH峰的出現(xiàn)。

臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，很多DOR患者在采用了CC微刺激方案后，由于過(guò)高的FSH水平和無(wú)卵泡發(fā)育，導(dǎo)致中途取消周期。而在PPOS方案中，P與位于下丘腦的P受體相結(jié)合，使GnRH的釋放頻率減慢，在發(fā)揮抑制早發(fā)LH峰發(fā)生的同時(shí)，也可在卵泡早期有效降低DOR患者過(guò)高的FSH水平。當(dāng)FSH降至正常范圍，E2慢慢上升，且卵巢有與之相匹配的基礎(chǔ)卵泡時(shí)，采用外源性Gn來(lái)發(fā)揮促排卵作用。由于DOR患者對(duì)大劑量Gn反應(yīng)欠佳，因此本研究選擇小劑量hMG (75～150 U/d) 進(jìn)行促排卵。本研究顯示，DOR患者在接受PPOS治療時(shí)，Gn的平均用量及時(shí)間明顯大或長(zhǎng)于CC組(P<0.001)。這可能與CC本身具有促排卵作用，無(wú)需外源性Gn的添加相關(guān)。實(shí)驗(yàn)室結(jié)局顯示兩組患者在獲卵數(shù)(率)、 成熟卵數(shù)、正常受精卵數(shù)、卵裂數(shù)及有效胚胎數(shù)與CC組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示PPOS方案可以有效抑制DOR患者促排卵過(guò)程中早發(fā)LH峰的發(fā)生，實(shí)驗(yàn)室結(jié)果顯示該方案可獲得與CC微刺激方案相似的卵子和可用胚胎。結(jié)果說(shuō)明PPOS是一種適合DOR患者的促排卵方案，為DOR患者的臨床用藥提供了更多選擇。今后將進(jìn)一步回顧性分析兩種方案所獲得的胚胎移植后結(jié)局，并設(shè)計(jì)前瞻性多中心隨機(jī)對(duì)照研究，進(jìn)一步確定PPOS方案的臨床有效性。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。