仲思怡， 高蜀君

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院宮頸疾病診療中心，上海 200001

隨著宮頸癌篩查的普及和陰道鏡的廣泛應(yīng)用，陰道上皮內(nèi)瘤變(vaginal intraepithelial neoplasia，VaIN)的檢出率逐漸上升。2013年至2015年VaIN占下生殖道上皮內(nèi)瘤變的比例分別為8.09%(372/4 598)、12.45%(717/5 760)、13.08%(834/6 374)[1]，引起越來越多的臨床關(guān)注。目前認(rèn)為高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus，HR-HPV)持續(xù)感染為病變發(fā)生、進(jìn)展及復(fù)發(fā)的主要原因。但并非所有HR-HPV感染均會(huì)發(fā)生持續(xù)感染，繼而導(dǎo)致病變的發(fā)生，提示尚有其他未知因素作用其中。

既往研究[2]發(fā)現(xiàn)，陰道微生態(tài)失衡為HR-HPV持續(xù)感染的高危因素。絕經(jīng)后女性由于卵巢功能衰退,雌激素水平降低,乳桿菌含量減少，陰道微生態(tài)平衡狀態(tài)被打破，更易發(fā)生HR-HPV的持續(xù)感染。本研究擬收集、分析復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院經(jīng)陰道鏡定位活檢或組織病理學(xué)檢查確診為VaIN的絕經(jīng)后女性和宮頸癌篩查雙陰性的絕經(jīng)后女性的相關(guān)臨床資料，比較VaIN與正常人群陰道微生態(tài)的差異，探討陰道微生態(tài)與HR-HPV持續(xù)感染及VaIN的關(guān)系，為HR-HPV感染的絕經(jīng)后女性VaIN的防治提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2020年5月至2020年8月于復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院宮頸疾病診療中心就診的絕經(jīng)后女性，因各種指征行陰道鏡檢查，并經(jīng)活組織檢查診斷為VaIN的160例患者作為病變組。根據(jù)病變級(jí)別進(jìn)一步分為低度上皮內(nèi)病變(low-grade squmous interaepithelial lesion, LSIL)組(n=125)及高度上皮內(nèi)病變(high-grade squmous interaepithelial lesion, HSIL)組(n=35)。另選同期于本院預(yù)防保健科體檢的HPV陰性且液基細(xì)胞檢測(liquid-based cytologic test，LCT)陰性的健康絕經(jīng)后女性志愿者50例為對(duì)照組，分析組間臨床資料差異，并進(jìn)一步比較組間陰道微生態(tài)的差異。納入標(biāo)準(zhǔn)：取樣前1周未使用抗生素；無陰道沖洗、上藥史；24 h內(nèi)無性生活。本研究已獲得復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-144)。

1.2 檢測方法

1.2.1 陰道微生態(tài)檢測 用3支干棉簽在陰道側(cè)壁上1/3取少量陰道分泌物。1支涂抹于清潔載玻片后,鏡下進(jìn)行分泌物清潔度評(píng)分，檢查是否存在滴蟲、菌絲、線索細(xì)胞等；1支經(jīng)革蘭染色后行Nugent評(píng)分及菌群密集度、多樣性評(píng)分；1支用于陰道微生物功能及炎癥反應(yīng)指標(biāo)檢測，試劑盒購自江蘇碩世生物科技股份有限公司，經(jīng)bPR-2014A陰道炎自動(dòng)檢測工作站分析結(jié)果。

1.2.2 LCT檢測 用擴(kuò)陰器充分暴露宮頸/陰道殘端，清潔表面分泌物后，采用特定刷頭按順時(shí)針?biāo)⑷?biāo)本，放入裝有樣本保存液的樣本管中，旋緊瓶蓋送檢。根據(jù)Bethesda細(xì)胞學(xué)分類法(the Bethesda system, TBS)將LCT結(jié)果分為無上皮內(nèi)病變及惡性病變細(xì)胞(no intraepithelial lesion or malignant cells, NILM)、非典型鱗狀上皮細(xì)胞-不能明確意義(atypical squamous cells of undetermined significance, ASCUS)、LSIL、非典型鱗狀上皮細(xì)胞-不除外高度上皮內(nèi)病變(atypical squamous cells: cannot exclude high-grade squamous intraepithelial lesion, ASC-H)、HSIL。

1.2.3 HR-HPV檢測 用擴(kuò)陰器充分暴露宮頸/陰道殘端，清潔表面分泌物后，采用特定刷頭按順時(shí)針?biāo)⑷?biāo)本，送病理科，采用多重?zé)晒釶CR分管分型檢測。

1.2.4 陰道鏡檢查和病理組織學(xué)檢查 患者取膀胱截石位，采用萊斯康公司型號(hào)D-10625陰道鏡,由專職醫(yī)生全方位檢查外陰、陰道以及宮頸，依次進(jìn)行醋白試驗(yàn)和碘染色,對(duì)可疑區(qū)域進(jìn)行活檢，送病理組織學(xué)檢查。由具有高級(jí)職稱的病理科醫(yī)師進(jìn)行診斷。異常檢驗(yàn)結(jié)果按世界衛(wèi)生組織(WHO)第4版《女性生殖器官腫瘤分類》二級(jí)分類法分為LSIL及HSIL。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 陰道微生態(tài)功能學(xué)指標(biāo) 過氧化氫<2 μmol/L時(shí)為陽性，白細(xì)胞酯酶≥9 U/L時(shí)為陽性，唾液酸苷酶≥7 U/mL時(shí)為陽性，β-葡萄糖醛酸酶≥0.5 g/L為陽性，乙酰氨基葡萄糖苷酶≥0.1 U/mL為陽性。

1.3.2 正常陰道微生態(tài) 菌群密集度Ⅱ～Ⅲ級(jí)，菌群多樣性Ⅱ～Ⅲ級(jí)，優(yōu)勢菌為革蘭陽性大桿菌，清潔度Ⅰ度，分泌物中未見滴蟲、孢子及菌絲等，乳桿菌功能正常(過氧化氫陰性、白細(xì)胞酯酶陰性)，pH值：3.8～4.5。

1.3.3 陰道炎診斷 陰道分泌物中測及陰道毛滴蟲、菌絲及孢子診斷為相應(yīng)陰道炎。

1.3.4 HR-HPV感染 檢測HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 39、HPV 45、HPV 51、HPV 52、HPV 56、HPV 58、HPV 59、HPV 66、HPV 68是否為陽性。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料分析 結(jié)果(表1)顯示：病變組平均年齡(58.17±5.39)歲，對(duì)照組平均年齡(56.18±4.60)歲。病變組中行全子宮切除患者占40%(64/160)，對(duì)照組中行全子宮切除患者占16%(8/50)。病變組中LSIL患者125例，平均年齡(58.35±5.39)歲，HSIL患者35例，平均年齡為(57.51±5.42)歲。LSIL中行全子宮切除患者占32%(40/125)，HSIL中行全子宮切除患者占68.57%(24/35),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。此外，LSIL組中既往接受放射治療者占0.8%(1/125)，HSIL組中既往接受放射治療者占8.57%(3/35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.009)。兩病變亞組其余臨床特征差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 HR-HPV感染情況 結(jié)果(圖1)顯示：病變組患者中HR-HPV感染率為63.1%(101/160)；LSIL組中HR-HPV感染率為57.6%(72/125)，HSIL組中HR-HPV感染率為82.86%(29/35)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006)。感染者中最常見HPV 16，占25.6%；其次為HPV 52，占10%。

表1 病變組臨床特征 n(%)

圖1 LSIL組(A)和HSIL組(B)中HR-HPV類型分布

2.3 HPV陽性患者在LSIL和HSIL組中的分布 結(jié)果(表2)顯示：LSIL及HSIL組中單一HPV感染率均高于多重HPV感染。LSIL組HR-HPV陽性患者中單一型感染率為58.33%(42/72)，HSIL組HR-HPV患者中單一型HR-HPV感染率為82.76%(24/29)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.020)。

表2 HPV陽性患者在LSIL及HSIL組中分布情況 n(%)

2.4 陰道微生態(tài)狀況 210例絕經(jīng)后女性陰道微生態(tài)普遍失調(diào)：過氧化氫陽性率(92.38%，194例)明顯升高，177例(84.29%)伴多樣性降低，117例(55.71%)密集度降低，優(yōu)勢菌以革蘭陽性短桿菌為主(89.52%)，Nugent評(píng)分異常者占47.14%。其中，滴蟲性陰道炎8例(3.80%)，霉菌性陰道炎19例(9.05%)。2.4.1 LSIL組和HSIL組陰道微生態(tài)比較 結(jié)果(表3、表4)顯示：LSIL及HSIL組患者的陰道微生態(tài)形態(tài)學(xué)及功能學(xué)各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 陰道LSIL組與HSIL組微生態(tài)形態(tài)學(xué)比較 n(%)

2.4.2 VaIN組與對(duì)照組陰道微生態(tài)比較 結(jié)果(表5、表6)顯示：比較病變組、對(duì)照組的陰道微生態(tài)各指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，形態(tài)學(xué)指標(biāo)中，多樣性、優(yōu)勢菌及Nugent評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。功能學(xué)指標(biāo)中，病變組較對(duì)照組白細(xì)胞酯酶陽性率升高、乙酰氨基葡萄糖苷酶陽性率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 LSIL組與HSIL組陰道微生態(tài)功能學(xué)比較 n(%)

表5 病變組與對(duì)照組微生態(tài)形態(tài)學(xué)比較 n(%)

表6 病變組與對(duì)照組微生態(tài)功能學(xué)比較 n(%)

2.5 VaIN發(fā)病危險(xiǎn)因素分析 結(jié)果(表7、圖2)顯示：白細(xì)胞酯酶陽性、多樣性升高和優(yōu)勢菌異常與VaIN發(fā)生明顯相關(guān)(P<0.05),OR及95%CI分別為1.251(1.101 4～1.421 1)、0.791(0.672 5～0.931 1)和1.242(1.031 3～1.496 7)。優(yōu)勢菌異常及白細(xì)胞酯酶陽性為發(fā)病的危險(xiǎn)因素，菌群多樣性升高為發(fā)病的危險(xiǎn)因素。

表7 VaIN發(fā)病危險(xiǎn)因素的logistic回歸分析

圖2 VaIN發(fā)病危險(xiǎn)因素森林圖

3 討 論

VaIN高危因素包括年齡、HR-HPV感染、既往因?qū)m頸HSIL或?qū)m頸癌行子宮切除術(shù)和放療病史等[3]，其中HR-HPV持續(xù)感染為VaIN發(fā)生發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素[4]，以HPV 16最為常見[5]。80%HPV感染為一過性，在數(shù)月至2年內(nèi)機(jī)體自然清除，僅少部分女性會(huì)持續(xù)感染，最終導(dǎo)致病變的發(fā)生發(fā)展[6]，提示其他因素在此過程中發(fā)揮一定作用。近年來，隨著流行病學(xué)及分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，陰道微生態(tài)與HR-HPV持續(xù)感染及鱗狀上皮內(nèi)病變發(fā)生的相關(guān)性開始受到關(guān)注。陰道微生態(tài)由微生物菌群、陰道機(jī)械屏障、局部免疫系統(tǒng)及宿主內(nèi)分泌功能共同組成，是一個(gè)動(dòng)態(tài)并相對(duì)平衡的體系。陰道正常菌群在微生態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[7]。除此之外，年齡、月經(jīng)、雌激素水平、吸煙、性交及衛(wèi)生習(xí)慣等也起著重要作用[8]。絕經(jīng)后女性體內(nèi)雌激素水平降低，菌群結(jié)構(gòu)改變，陰道上皮細(xì)胞變薄，細(xì)胞內(nèi)糖原含量減少，乳酸生成減少，陰道內(nèi)pH上升，打破微生態(tài)平衡，病原微生物易入侵，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致病變的發(fā)生。

陰道微生物菌群的穩(wěn)定性及組成在宿主固有免疫應(yīng)答及對(duì)病原微生物的易感性中發(fā)揮重要作用。正常情況下，陰道微生態(tài)群中乳桿菌占主導(dǎo)地位。乳桿菌可分解陰道上皮糖原，產(chǎn)生大量乳酸維持陰道酸性環(huán)境[2,9]，產(chǎn)生過氧化氫及細(xì)菌素等[10]維持上皮屏障，抑制病原微生物入侵。測定過氧化氫濃度可間接反乳桿菌的功能。乳桿菌減少或活性下降，均可導(dǎo)致機(jī)會(huì)性感染概率上升。既往研究[11]表明，絕經(jīng)后女性陰道內(nèi)乳桿菌含量遠(yuǎn)低于正常育齡女性。周燕等[12]對(duì)4 630例絕經(jīng)后婦女進(jìn)行陰道微生態(tài)分析發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性乳桿菌數(shù)量及功能均降低，優(yōu)勢菌為乳桿菌患者占30.8%，過氧化氫陽性者占91.04%。本研究中對(duì)照組健康絕經(jīng)后女性陰道優(yōu)勢菌為乳桿菌者占20%，陰道病變組中僅7.5%，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)，提示陰道上皮內(nèi)病變發(fā)生與陰道內(nèi)乳桿菌數(shù)目減少有關(guān)。過氧化氫陽性在病變組占93.13%，在對(duì)照組占90.00%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能提示，較功能而言，乳桿菌數(shù)目增加在抑制發(fā)病中起到更重要的作用。

菌群多樣性是機(jī)體健康與否的標(biāo)志，陰道微生物菌群高度多樣化常被認(rèn)為與疾病狀態(tài)相關(guān)[13]。既往研究[14]指出，絕經(jīng)后女性陰道菌群多樣性較育齡期女性顯著下降，多樣性升高為一種陰道微生態(tài)失衡狀態(tài)，常與厭氧菌感染有關(guān)[15]。該類患者更易發(fā)生HPV的持續(xù)感染及宮頸上皮病變[16]。Brotman等[17]發(fā)現(xiàn)，菌群多樣性升高伴乳桿菌數(shù)目減少的患者更易獲得HPV感染甚至是持續(xù)性感染。Mitra等[16]將宮頸LSIL、宮頸HSIL、宮頸癌患者陰道微生態(tài)與正常健康女性陰道微生態(tài)相比發(fā)現(xiàn)，LSIL患者CST Ⅳ發(fā)生率較正常女性升高2倍，HSIL患者升高3倍，而浸潤性宮頸癌患者則升高了4倍，且隨著病變等級(jí)升高，陰道乳桿菌數(shù)目逐漸減少。北大第一醫(yī)院婦產(chǎn)科的一項(xiàng)橫截面研究[18]根據(jù)HPV、TCT及組織病理學(xué)結(jié)果將就診患者分為對(duì)照組，HR-HPV陽性組及宮頸癌組。對(duì)比研究其陰道微生態(tài)發(fā)現(xiàn)，健康女性、HR-HPV陽性女性及宮頸癌女性陰道菌群多樣性逐漸升高。本研究中病變組女性菌群多樣性降低者占81.25%，顯著少于對(duì)照組女性94.00%(P<0.05)，與既往研究一致，提示多樣性增加在VaIN的發(fā)生發(fā)展中起到一定作用。

白細(xì)胞酯酶為白細(xì)胞的特異性酯酶，其陽性提示陰道黏膜受損。陰道分泌物中大量多核白細(xì)胞被破壞而釋放該酶，表示存在炎癥反應(yīng)，與白細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)，能間接反映病原微生物的增殖水平[19]。炎癥反應(yīng)是把雙刃劍，其為宿主抵抗有害刺激免疫防御的第1步，可激活嗜中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其遷移到炎癥部位釋放細(xì)胞因子等維持免疫反應(yīng)，在機(jī)體免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用[20-21]。但若炎癥持續(xù)，組織持續(xù)暴露于慢性炎癥中將會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞群改變，損害細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，引發(fā)惡性轉(zhuǎn)化[22]。Kemp等[23]對(duì)比發(fā)現(xiàn)，HPV持續(xù)感染女性炎癥因子較健康女性明顯增加。國內(nèi)外研究[19]表明，宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變與白細(xì)胞酯酶陽性顯著相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)病變組較對(duì)照組白細(xì)胞酯酶陽性率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，進(jìn)一步證實(shí)炎癥反應(yīng)在病變發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，眾多因素參與VaIN的發(fā)生發(fā)展，陰道微生態(tài)的變化在其中起到關(guān)鍵作用，陰道微生態(tài)平衡破壞可能對(duì)VaIN發(fā)生有促進(jìn)作用。本研究首次表明，特定的陰道微生態(tài)特點(diǎn)(如優(yōu)勢菌乳桿菌豐度降低、菌群多樣性增加及機(jī)體炎癥等)與VaIN發(fā)生密切相關(guān)。該發(fā)現(xiàn)能為未來臨床診療提出新的思路，如：是否可以通過陰道微生態(tài)檢測對(duì)該類患者進(jìn)行分流；伴有該微生態(tài)特點(diǎn)的人群是否應(yīng)接受更嚴(yán)格的陰道鏡檢查；改善該部分患者的陰道微生態(tài)是否能對(duì)抵抗HPV持續(xù)感染及改善相關(guān)病變的轉(zhuǎn)歸起到積極作用等。其具體分子機(jī)制則需要未來更多基礎(chǔ)研究加以證實(shí)。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。