張紅印，韓榮欣，肖鳳琴，王海東，嚴(yán)銘銘, ，趙大慶

1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)（長(zhǎng)春 130117）；2. 吉林省中藥保健食品科技創(chuàng)新中心（長(zhǎng)春 130117）

中藥酸棗仁始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是中國(guó)傳統(tǒng)常用中藥，其來(lái)源為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujubaMill. var.spinosa（Bunge）Hue x H. F. Chou的干燥成熟種子[1]，收錄于2002年頒發(fā)的《既是食品又是藥品的物品名單》。迄今為止，在酸棗仁中鑒定出化合物150余種，包括萜類(lèi)、生物堿、類(lèi)黃酮、脂肪酸、揮發(fā)油、多糖等。藥理試驗(yàn)研究表明，酸棗仁提取物和純化的化合物都具有良好的生物活性，特別是鎮(zhèn)靜催眠的作用[2-3]。

作為種子類(lèi)藥材，酸棗仁含有豐富的天然蛋白質(zhì)資源，蛋白含量占27%以上。酸棗仁蛋白含有18種常見(jiàn)氨基酸，人體必需氨基酸含量占總氨基酸的23.60%，其中色氨酸含量最豐富，非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的30.95%，表明酸棗仁蛋白是一種開(kāi)發(fā)潛力很高的優(yōu)質(zhì)蛋白[4-5]。對(duì)于酸棗仁組分蛋白的研究尚未報(bào)道，表明對(duì)于酸棗仁蛋白質(zhì)資源并未充分利用，因此，驗(yàn)證和探討酸棗仁蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成，能夠更有效合理利用酸棗仁資源，提高產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

試驗(yàn)以酸棗仁脫脂粉為原料，以不同組分蛋白的提取率為考察指標(biāo)，通過(guò)比較不同蛋白提取條件，確定各組分蛋白的最佳提取工藝，對(duì)所得的組分蛋白進(jìn)行亞基組成分析，為酸棗仁藥材在藥食同源的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

不同批次酸棗仁樣品（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院）。

1.2 試驗(yàn)試劑

考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、甘油、十二烷基硫酸鈉、巰基乙醇、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、APS、Tris、氨基乙酸、低分子量蛋白質(zhì)Marker（北京索萊寶科技有限公司）；石油醚、無(wú)水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、三氯乙酸、磷酸、尿素、甲醇等（均為分析級(jí)試劑）。

1.3 設(shè)備與儀器

Sigma微型離心機(jī)（德國(guó)Sigma有限公司）；UV-1700紫外分光光度計(jì)[日本島津（中國(guó)）有限公司]；電子分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司]；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市佳美儀器有限公司）；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；低溫離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；SCIENTZ-50F冷凍干燥機(jī)（寧波新芝凍干設(shè)備股份有限公司）。

1.4 脫脂酸棗仁粉制備

將酸棗仁進(jìn)行粉碎，過(guò)四號(hào)篩，得酸棗仁粉。將所得酸棗仁粉按照料液比1∶5（g/mL）加入石油醚，在室溫下攪拌12 h，以5000 r/min離心10 min，收集沉淀，重復(fù)操作1次，將所得沉淀置于通風(fēng)櫥內(nèi)，待石油醚揮發(fā)干凈后，將脫脂粉收集備用。

1.5 酸棗仁蛋白分級(jí)提取

采用Osborne分級(jí)分離方法[6]對(duì)酸棗仁蛋白進(jìn)行分離。

1.5.1 清蛋白提取

取一定量脫脂酸棗仁粉，按照料液比1∶10（g/mL）加入蒸餾水，在25，35，45和55 ℃溫度條件下分別攪拌1，2，3和4 h，以70000 r/min離心10 min，取上清液，透析，冷凍干燥。

1.5.2 球蛋白的提取

將清蛋白提取后的沉淀，按照料液比1∶10（g/mL），加入1%，2%，3%，4%，5%和6% NaCl溶液，分別攪拌1，2，3和4 h，離心后取上清液，即為球蛋白溶液，透析，冷凍干燥。

1.5.3 醇溶蛋白的提取

將球蛋白提取后的沉淀，按照料液比1∶10（g/mL），加入50%，60%，70%和80%乙醇溶液，分別攪拌1，2，3和4 h，離心后取上清液，即為醇溶蛋白溶液，透析，冷凍干燥。

1.5.4 谷蛋白的提取

將醇溶蛋白提取后的沉淀，按料液比1∶10（g/mL），加入0.01，0.05，0.10和0.15 mol/L的NaOH溶液，分別攪拌1，2，3和4 h，離心后取上清液，即為谷蛋白溶液，透析，冷凍干燥。

1.6 蛋白溶液濃度測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)比色法[7]測(cè)定。

1.7 組分蛋白提取率及化學(xué)組成分析

1.7.1 各組分蛋白提取率計(jì)算

對(duì)最佳提取工藝下獲得的酸棗仁組分蛋白進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

1.7.2 各組分蛋白化學(xué)組成分析

對(duì)最佳提取工藝下獲得的酸棗仁組分蛋白進(jìn)行化學(xué)組成分析。水分的測(cè)定參照GB 5009.3—2016《食品中水分的測(cè)定》的直接干燥法；蛋白的測(cè)定參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》的凱氏定氮法；脂肪的測(cè)定參照GB/T 5009.6—2006《食品中脂肪的測(cè)定》的索式抽提法；灰分的測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測(cè)定》的質(zhì)量法。

1.8 酸棗仁蛋白組分SDA-PAGE電泳

參考Laemmli[8]的方法。將冷凍干燥的組分蛋白粉與上樣緩沖液，按1∶1的比例混合。將混合物置于沸水中加熱3～5 min，待溫度降至室溫后，進(jìn)行上樣。濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，樣品上樣量10 μL。恒壓電泳，濃縮膠電壓70 V，時(shí)間30 min，分離膠電壓140 V，時(shí)間60 min。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍(lán)（R250）染色30 min，脫色后，Invitrogen iBright FL 1000（美國(guó)賽默飛世爾科學(xué)公司）掃描成像。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)都重復(fù)3次后取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Origin 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸棗仁蛋白脫脂工藝的考察

對(duì)不同批次酸棗仁藥材進(jìn)行粉碎后，對(duì)石油醚脫脂效率進(jìn)行考察（表1），結(jié)果表明，酸棗仁藥材脫脂效率穩(wěn)定，但小于索氏提取法[9]，由于操作簡(jiǎn)便、脫脂量大，以石油醚為脫脂溶劑可回收再利用，因此更適用于工業(yè)生產(chǎn)。

表1 不同批次酸棗仁粉石油醚脫脂效率考察

2.2 單因素考察結(jié)果

2.2.1 不同溫度對(duì)酸棗仁清蛋白提取的影響

由圖1可知，隨著提取時(shí)間增加，清蛋白提取率逐漸增長(zhǎng)，在45 ℃條件下提取率達(dá)到最大值。溫度是影響蛋白質(zhì)溶解度的主要物理因素之一，在一定溫度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度增加而增大，其主要原因是溫度能夠使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，發(fā)生變性反應(yīng)，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，分散性增加，有利于酸棗仁清蛋白質(zhì)溶出，提高提取效率[10-12]。但在55 ℃條件下，酸棗仁清蛋白的提取率隨提取時(shí)間增加呈下降趨勢(shì)，表明提取溫度過(guò)高會(huì)破壞蛋白的主要結(jié)構(gòu)，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性沉淀。

圖1 不同溫度對(duì)酸棗仁清蛋白濃度的影響

2.2.2 不同NaCl溶液濃度對(duì)酸棗仁球蛋白提取的影響

由圖2可知，在NaCl濃度1%～6%范圍內(nèi)，隨著NaCL濃度增加，酸棗仁球蛋白隨著時(shí)間增加提取率逐漸增大；NaCl濃度5%時(shí)，蛋白提取率最高。鹽濃度繼續(xù)增加到6%時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著時(shí)間增長(zhǎng)有所降低。原因主要是溶液中的鹽離子會(huì)影響蛋白質(zhì)分子之間的靜電吸引和排斥相互作用，在低濃度鹽溶液中，由于鹽溶效應(yīng)，離子強(qiáng)度增加，蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)增加，但濃度達(dá)到一定水平時(shí)，帶電蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸減少，導(dǎo)致分子間排斥相互作用會(huì)隨著溶液離子強(qiáng)度增加而降低[13-14]。

圖2 不同NaCl溶液濃度對(duì)酸棗仁球蛋白濃度的影響

2.2.3 不同乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)酸棗仁醇溶蛋白提取的影響

有機(jī)溶劑能夠改變蛋白質(zhì)的疏水作用、氫鍵和靜電相互作用的穩(wěn)定性，極易引起蛋白質(zhì)變性沉淀，主要是由于有機(jī)溶劑能夠降低水的介電常數(shù)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)之間的靜電斥力降低。醇溶蛋白結(jié)構(gòu)較為特殊，含有大量疏水性氨基酸和含硫氨基酸，使其具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能特性，如良好的成膜性、彈性和疏水性等[15]。由圖3可知，隨著提取時(shí)間增加，醇溶蛋白質(zhì)提取率多呈增大趨勢(shì)。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)提高，醇溶蛋白提取率增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%時(shí)，醇溶蛋白提取率達(dá)到最大值，表明此時(shí)酸棗仁醇溶蛋白與醇溶液之間的相互作用到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)，乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)80%時(shí)，隨著提取時(shí)間增加，蛋白發(fā)生變性導(dǎo)致沉淀，溶解度降低。

圖3 不同乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)酸棗仁醇溶蛋白濃度的影響

2.2.4 不同NaOH溶液濃度對(duì)谷蛋白提取的影響

由圖4可知，隨著NaOH濃度逐漸增加，谷蛋白提取率逐漸增加。NaOH濃度0.1 mol/L時(shí)，谷蛋白提取率達(dá)到最大值。在堿性環(huán)境下，隨堿溶液濃度增高，蛋白空間結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，二硫鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致疏水性降低，從而增加蛋白質(zhì)溶解度。

圖4 不同NaOH溶液濃度對(duì)酸棗仁谷蛋白濃度的影響

2.3 組分蛋白提取率及化學(xué)組成分析

對(duì)酸棗仁脫脂粉及提取凍干后的蛋白粉末進(jìn)行化學(xué)組成分析，結(jié)果如表2所示。酸棗仁脫脂粉中最主要的成分是蛋白質(zhì)，達(dá)到55.17%。采用最佳提取工藝提取的組分蛋白，其蛋白提取率分別為清蛋白13.24%、球蛋白22.25%、醇溶蛋白1.35%、谷蛋白13.57%，且4種酸棗仁組分蛋白的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在80%以上，其中球蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到88.69%；酸棗仁蛋白的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低于2%，其中球蛋白的粗脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)低至0.72%，說(shuō)明該方法能較為有效地分離蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)；清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的灰分分別為1.89%，1.21%，1.05%和1.45%，表明經(jīng)過(guò)透析后，蛋白提取液中的鹽離子能較大程度地被除去。化學(xué)組成分析結(jié)果表明四步分離法能對(duì)酸棗仁蛋白進(jìn)行初步分離提純，得到純度較高的酸棗仁蛋白各組分。

表2 酸棗仁組分蛋白化學(xué)組成的比較 單位：%

2.4 酸棗仁蛋白組分電泳分析

由圖5和圖6可知，在不同溫度條件下酸棗仁清蛋白亞基組成有較大區(qū)別。在45 ℃條件下，亞基條帶較多，說(shuō)明此條件下對(duì)清蛋白的各亞基組分均有較好的提取率。清蛋白的亞基分布在相對(duì)分子質(zhì)量1～55 kDa。此外，添加β-巰基乙醇后，清蛋白的亞基條帶增多，說(shuō)明清蛋白含有二硫鍵。在不同鹽濃度條件下，提取所得酸棗仁球蛋白在電泳圖譜中均呈現(xiàn)相同的亞基條帶，這說(shuō)明鹽濃度對(duì)球蛋白的提取率有較大影響，但對(duì)亞基組成的影響較小，相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在10～25 kDa。由于β-巰基乙醇添加前后，球蛋白亞基條帶有較大變化，推測(cè)球蛋白中也含有二硫鍵。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% NaCl溶液中，球蛋白提取率最高，出現(xiàn)的條帶顏色深。圖5中分布在相對(duì)分子質(zhì)量35 kDa左右的球蛋白亞基，在還原劑的存在下，二硫鍵斷裂，遷移率變大，大部分分布在14～25 kDa之間。在不同醇濃度條件下，未見(jiàn)醇溶蛋白條帶，還原前后的電泳條帶也未有變化，表明醇溶蛋白較少，或者醇溶蛋白未能進(jìn)入分離膠中。酸棗仁谷蛋白亞基主要分布于15～55 kDa，堿濃度對(duì)酸棗仁谷蛋白亞基組成有較大影響，濃度0.1 mol/L時(shí)條帶明顯。圖6中分布在相對(duì)分子質(zhì)量25～55 kDa的谷蛋白亞基，在還原劑存在下，二硫鍵斷裂，遷移率變大，大部分分布在15～25 kDa。通過(guò)比較圖5與圖6，谷蛋白在25～55 kDa的亞基可能是通過(guò)二硫鍵交聯(lián)形成的。

圖5 還原性酸棗仁組分蛋白SDS-PAGE結(jié)果

圖6 非還原性酸棗仁組分蛋白SDS-PAGE結(jié)果

3 結(jié)論

基于Osborne分級(jí)提取法對(duì)酸棗仁組分蛋白進(jìn)行分級(jí)提取，通過(guò)單因素考察對(duì)各提取影響因素進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后確定各組分蛋白最佳提取工藝條件：清蛋白提取最佳溫度為45 ℃，球蛋白提取最佳鹽濃度為5%，醇溶蛋白提取的最佳醇濃度為70%，谷蛋白提取最佳堿濃度為0.1 mol/L；針對(duì)最佳工藝獲得的組分蛋白，其蛋白提取率的大小為球蛋白＞谷蛋白＞清蛋白＞醇溶蛋白，化學(xué)組成分析表明各組分蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均在80%以上，表明此提取方法是準(zhǔn)確可行的。酸棗仁清蛋白和球蛋白的亞基主要分布在相對(duì)分子質(zhì)量10～55 kDa，分布在25～55 kDa的清蛋白、球蛋白和谷蛋白亞基可能是通過(guò)二硫鍵作用形成的。酸棗仁醇溶蛋白可能是大分子蛋白，還原性與非還原性電泳未檢測(cè)到其明顯條帶。此外，清蛋白包含酸棗仁蛋白中的大部分亞基，從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度分析，其營(yíng)養(yǎng)更為均衡。綜上所述，不同提取條件對(duì)酸棗仁蛋白的提取率有較大影響，且在一定程度上影響蛋白亞基組成。