額爾敦巴雅爾，扈寧軒，鄧雅文，云雪艷，董同力嘎

內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（呼和浩特 010018）

花椒（Zanthoxylum bungeanum）原產(chǎn)于中國平原和海拔較高的山地[1]，因含有豐富的揮發(fā)性物質(zhì)而具有特殊香氣。近年來，黃酮物質(zhì)因具有廣泛的藥理作用而備受關(guān)注，以抗氧化活性尤為突出，并且在降低膽固醇、抑制炎癥物質(zhì)流出、抑制癌細(xì)胞產(chǎn)生方面具有突出功效[2]。花椒也由于較高的經(jīng)濟(jì)價值而不斷擴大種植面積，但中國對花椒中黃酮物質(zhì)的研究相對不足，對提取物的系統(tǒng)性研究也比較欠缺[3]。因此，從花椒黃酮提取物的提取工藝、純化工藝、提取物定性分析及體外抗氧化活性4個方面展開，為該物質(zhì)的環(huán)保工業(yè)化提取及體外活性研究提供參考依據(jù)，對中國花椒產(chǎn)品的開發(fā)利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒殘渣（洗凈后烘干備用，四川漢源）；蘆?。ā?8%，上海順勃有限公司）；D101大孔吸附樹脂（南開大學(xué)化工廠）；無水乙醇、石油醚（30～60 ℃）、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純）；乙腈、異丙醇、甲酸（均為質(zhì)譜純）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀Agilent 1100系列（美國Agilent公司）；Agilent Poroshell 120 SBC18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm，美國Agilent公司）；Waters Acquity UPLC液相色譜儀（美國Waters公司）；Synapt G2-S Q-TOF質(zhì)譜儀（配有Empower 3.0工作站和MassLynxV 4.1分析軟件，美國Waters公司）。

1.3 溶劑法提取花椒渣中的黃酮

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考謝宗波等[4]的方法，配制0.1 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，于20 mL比色管依次加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液、5%亞硝酸鈉溶液、10%硝酸鋁溶液和5%氫氧化鈉溶液，用30%甲醇稀釋至比色管刻度，分別配制為0，0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品，搖勻放置15 min后測定其在508 nm下吸光度。

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

將溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、料液比和提取時間作為變量設(shè)置4個單因素試驗，產(chǎn)物過濾后得到花椒渣黃酮粗提物，分別測得花椒渣黃酮得率作為評價指標(biāo)。

4個單因素試驗依次確定工藝參數(shù)。分別測定甲醇體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%和80%時的花椒渣黃酮得率。選擇最佳體積分?jǐn)?shù)甲醇作為萃取溶劑，分別測定提取溫度15，25，35，45和55 ℃這5個溫度下的花椒渣黃酮得率。保持上述溶劑濃度，選擇最佳提取溫度，分別測定料液比1∶4，1∶6，1∶8，1∶10和1∶12（g/mL）時的花椒渣黃酮得率。在試驗得出的最佳條件下，分別測定提取靜置時長2，3，4，5，6和7 h時的花椒渣黃酮得率，得出最優(yōu)組合的工藝參數(shù)。

1.3.3 黃酮得率的測定

取3.0 mL粗提液置于10 mL比色管中，按1.3.1中提到的方法顯色，以試劑空白作為對照測定其508 nm處吸光度，由標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線按式（1）計算出黃酮得率。

式中：C為樣液的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣液的體積，mL；W為花椒殘渣質(zhì)量，g。

1.3.4 黃酮純度的測定

稱取10.0 g干燥的花椒渣粉末，萃取后除去溶劑甲醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后用烘箱干燥得到黃酮粉末。用30%甲醇溶解20 mg花椒殘渣黃酮粉末定容至400 mL，取6.0 mL該溶液移入20 mL比色管中，按照1.3.1的方法進(jìn)行顯色，以試劑空白作為對照測定其508 nm處的吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)蘆丁曲線計算提取液質(zhì)量濃度C，并按式（2）計算花椒殘渣黃酮純度。

式中：C為提取液質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；W為黃酮粉末質(zhì)量，mg。

1.4 花椒渣黃酮的定性分析

1.4.1 樣品液的制備

取10～20 mg樣品，以甲醇∶水∶甲酸比例1∶1∶0.5%的超聲條件溶解，以12000 r/min 離心后，取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，即得樣品液。

1.4.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS分析條件

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（ESI）離子源，質(zhì)量掃描范圍是m/z50～1200，毛細(xì)管電壓3 kV（負(fù)離子模式），樣品錐電壓40 V，提取錐電壓4 V，源溫110 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣流速度700 L/h，質(zhì)量掃描范圍m/z200～2000。

液相色譜分析條件：Agilent Poroshell 120 SBC18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相，A相為乙腈，B相為0.5%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～35 min，60%～84% A，35～114 min，84%～100% A，114～120 min，100%～60% A；流速0.2 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.5 體外活性評價

1.5.1 樣品液的制備

花椒總黃酮粗提物的制備：粉碎花椒后準(zhǔn)確稱取2.0 g粉末，用石油醚脫脂處理1 h。以70%甲醇作為溶劑，料液比1∶8（g/mL），室溫下浸提4 h，烘干得到粗提物粉末。

花椒總黃酮純化樣的制備：上述粗提物通過D101型的大孔樹脂的純化。純化控制條件：樣品液質(zhì)量濃度1.0 mg/mL，pH 4.0，以70%甲醇作為洗脫劑，用量3 BV，放入烘干箱烘干得到純化樣粉末。

1.5.2 DPPH自由基清除能力測定

試驗參考張宇思等[5]提到的方法并稍作改動。用甲醇將50 mg DPPH定容至250 mL容量瓶中，得到5×10-4mol/L DPPH溶液。以甲醇分別溶解花椒及花椒殘渣總黃酮粗提物、精制花椒及精制花椒殘渣總黃酮、BHT及VC，獲得質(zhì)量濃度0.01，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16和0.20 mg/mL的7組溶液。在這7組溶液中分別加入1.0 mL 5×10-4mol/L DPPH，添加甲醇至5 mL。室溫靜置30 min后測定517 nm處的吸光度。根據(jù)式（3）計算樣品的DPPH自由基清除率。

式中：A為不加樣的DPPH溶液（2.0 mL DPPH+2.0 mL甲醇）的吸光度；A1為樣品和DPPH混合后吸光度；A2為不加DPPH的樣液（樣品2.0 mL+2.0 mL甲醇）吸光度。

1.5.3 還原力的測定

試驗參考Oyaizu[6]和Amarowicz等[7]的方法并稍作改動。以70%甲醇為溶劑，配成質(zhì)量濃度0.20～0.50 mg/mL的樣品液。各取3 mL樣液于10支20 mL試管中，分別加入3 mL的0.01 g/mL鐵氰化鉀，混勻后在50 ℃水浴中保持30 min。加入3 mL 0.1 g/mL三氯乙酸，混合并以3000 r/min離心15 min。取3 mL上清液加入3 mL蒸餾水和1 mL 0.1 g/100 mL氯化鐵，混合靜置15 min后測700 nm處的吸光度，所有測定值取平均值3倍。

1.5.4 抑制脂質(zhì)過氧化活性的測定

試驗參考任紅榮等[8]的方法。用30 mL 10 mmol/L PBS（pH 7.4）溶解200 mg卵磷脂，冰浴振蕩混勻。取0.5 mL該液體，加入1.0 mL PBS（pH 7.4）、質(zhì)量濃度樣液1.0 mL，以及1 mL 2.5 mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ），混勻后于37 ℃水浴反應(yīng)45 min，加2.0 mL 0.28 g/mL三氯乙酸及1.0 mL 0.01 g/mL硫代巴比妥酸，搖勻靜置5 min，100 ℃恒溫水浴鍋中加熱10 min，冷卻后測各樣品在532 nm處的吸光度。每3個平行樣計算1次平均值。按式（4）計算脂質(zhì)過氧化抑制效率。

式中：A0為不含樣品的吸光度；A1為含樣品的吸光度。

1.5.5 測定總抗氧化能力

按照南京建城生物工程學(xué)院TAC測量試劑盒的說明進(jìn)行試驗。在37 ℃時，萃取液每分鐘使反應(yīng)體系中的吸光度增加0.01～1 TAC單位（IU），以IU/mL表示。測量花椒殘渣總黃酮總抗氧化能力為IU/mg，并做3次重復(fù)以獲所需數(shù)據(jù)平均數(shù)值，將抗壞血酸（VC）為陽性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.3.1中的方法，用最小二乘法得到關(guān)于蘆丁質(zhì)量濃度C和吸光度A的線性回歸曲線圖，由圖1可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度C在一定范圍內(nèi)與吸光度A呈現(xiàn)較好線性相關(guān)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 工藝參數(shù)的確定

2.2.1 甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)

由圖2可以看出，甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)40%～80%時，花椒殘渣的黃酮得率隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)增加而出現(xiàn)逐漸升高趨勢，并在甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)70%時達(dá)到最大值。隨著甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，曲線緩慢下降，這是由于溶劑體積分?jǐn)?shù)過高，導(dǎo)致蛋白質(zhì)凝固變性，抑制提取過程。所以甲醇溶液體積分?jǐn)?shù)選擇70%。

圖2 甲醇體積分?jǐn)?shù)對花椒殘渣黃酮得率的影響

2.2.2 提取溫度

由圖3看出，提取溫度15～55 ℃時，提取黃酮類物質(zhì)得率隨著提取溫度升高呈現(xiàn)先上升后緩慢下降趨勢，可能是由于低溫下體系的擴散系數(shù)比較小，影響提取效率；隨著溫度逐漸升高，黃酮可能存在一定氧化損失。提取溫度25 ℃時所對應(yīng)的黃酮得率最高，因此提取溫度選擇25 ℃。

圖3 提取溫度對花椒殘渣黃酮得率的影響

2.2.3 料液比

由圖4可以看出，料液比達(dá)到一定數(shù)值后，溶出物質(zhì)的能力就達(dá)到飽和，曲線呈現(xiàn)一種趨于平衡狀態(tài)。因此為避免溶劑浪費，提取料液比選擇1∶8（g/mL）。

圖4 料液比對于花椒殘渣黃酮得率的影響

2.2.4 浸提時間

由圖5可以看出，靜置時間2～7 h時，黃酮得率隨著提取時間增加在5 h達(dá)到最大值，而后開始下降。這是因為提取時間過長，提取液被氧化，以及放置時間過久而滋生細(xì)菌，其中的黃酮類物質(zhì)被微生物分解和利用。因此，浸提時間選擇5 h。

圖5 浸提時間對于花椒殘渣黃酮得率的影響

綜上所述，溫度為室溫25 ℃時，溶劑法提取花椒殘渣中黃酮最優(yōu)工藝條件為甲醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶8（g/mL），浸提靜置時間5 h。在此條件下，花椒殘渣黃酮得率為7.65%，干燥后的粗黃酮粉純度為23.4%。

2.3 花椒渣黃酮的定性分析

試驗使用正離子模式，結(jié)合黃酮物質(zhì)譜特征碎片（分別為m/z191，m/z289，m/z353，m/z431，m/z447和m/z463），并根據(jù)數(shù)據(jù)庫篩查，對提取的黃酮樣液中8種物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定，見表1?；ń窔堅S酮總離子流色譜圖見圖6。

圖6 花椒殘渣黃酮總離子流色譜圖

試驗利用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對純化后的花椒殘渣黃酮進(jìn)行分析[8]，純化精制后的花椒殘渣黃酮中主要含有8種物質(zhì)，通過UV光譜定性后，質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1。其中，山茶黃酮苷A、3’, 5, 7-三羥基-4’-甲氧基黃酮7蕓香苷、Lethedioside A和山奈酚-3-蕓香糖苷是首次在花椒殘渣中發(fā)現(xiàn)的。

表1 花椒殘渣黃酮的質(zhì)譜分析結(jié)果

2.4 花椒渣黃酮的體外活性測定

2.4.1 DPPH自由基的清除能力

花椒殘渣總黃酮對DPPH自由基的清除效果見圖7。在質(zhì)量濃度較低范圍內(nèi)曲線不斷上升，清除率增長。VC質(zhì)量濃度達(dá)到0.08 mg/mL后曲線上升緩慢，清除率基本保持不變?；ń窔堅兓瘶淤|(zhì)量濃度0～0.20 mg/mL范圍之內(nèi)，各組清除能力隨濃度增加而不斷增強?；ń窔堅傸S酮純化樣對DPPH自由基清除能力顯著強于其他組。花椒殘渣純化樣質(zhì)量濃度0.20 mg/mL時清除率達(dá)89%，僅低于同質(zhì)量濃度下清除率93.1%的VC。

圖7 花椒殘渣總黃酮的DPPH自由基清除能力

2.4.2 花椒渣總黃酮還原力的測定

一種物質(zhì)潛在的抗氧化性能與還原能力有著較為密切的聯(lián)系。由圖8可知，在質(zhì)量濃度0～0.40 mg/mL，各組還原能力均隨著其濃度升高而增強，但幅度不同?；ń窔堅傸S酮純化樣的還原力比BHT強，更高于其他提取物，但弱于VC。

圖8 花椒殘渣總黃酮的還原力

2.4.3 花椒渣總黃酮抗脂質(zhì)過氧化的能力

由圖9可知，花椒殘渣純化總黃酮對Fe2+誘導(dǎo)的卵磷脂脂質(zhì)體外過氧化具有抑制作用；而花椒殘渣未純化總黃酮、花椒純化總黃酮和花椒未純化總黃酮的抑制率低于BHT，證明花椒殘渣純化總黃酮具有較強的抗脂質(zhì)氧化能力。

圖9 花椒殘渣總黃酮抗脂質(zhì)過氧化能力

2.4.4 花椒渣總黃酮的總抗氧化能力

從圖10能看出4種提取樣的總抗氧化能力均隨其質(zhì)量濃度增加而不斷增強，這與抗壞血酸的抗氧化活性走向相同。

圖10 花椒殘渣總黃酮與VC的總抗氧化能力圖

經(jīng)過計算得出各組質(zhì)量濃度0.10 mg/mL時的總抗氧化能力：殘渣純化樣72.1 IU/mg，殘渣未純化樣34.3 IU/mg，花椒純化樣65.4 IU/mg，花椒未純化樣31.4 U/mg，VC總抗氧化力強于各提取樣。

經(jīng)過體外抗氧化試驗對花椒殘渣總黃酮的DPPH自由基清除能力、還原力、抗脂質(zhì)氧化能力和總抗氧化性能的研究，不難看出，殘渣中的總黃酮在清除羥自由基和抑制脂質(zhì)抗氧化的方面優(yōu)于合成的傳統(tǒng)抗氧化劑，可以確定該物質(zhì)具有較強抗氧化活性。

3 結(jié)論

花椒殘渣中的黃酮沒有明顯的毒副作用，具有作為天然抗氧化劑用于食品加工的潛力。通過4個單因素試驗，確定溶劑法提取花椒殘渣中黃酮的最佳溫度為25 ℃、甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶8（g/mL）、浸提時間為5 h。在此條件下，花椒殘渣總黃酮的得率達(dá)7.65%，花椒殘渣總黃酮干燥后的純度為23.4%。

采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對花椒殘渣中的黃酮進(jìn)行定性分析，共鑒定出8種化合物，其中山茶黃酮苷A、3’, 5, 7-三羥基-4’-甲氧基黃酮7蕓香苷、Lethedioside A和山奈酚-3-蕓香糖苷是首次在花椒殘渣中發(fā)現(xiàn)的。試驗結(jié)果可為開發(fā)花椒殘渣中黃酮類全系列有效成分提供理論數(shù)據(jù)。

由體外試驗得知，花椒殘渣純化總黃酮的DPPH自由基清除效果強于同質(zhì)量濃度的抗氧化劑BHT，但略微弱于VC；其還原力弱于VC，但高于同質(zhì)量濃度下BHT，其過氧化抑制率也高于BHT。此外，花椒殘渣總黃酮純化樣的總抗氧化能力高于花椒總黃酮純化樣。