寧俊帆，郭玉寶，宋 睿，朱世民，董 鵬

安徽工程大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000

引 言

稻谷收獲后即開(kāi)始陳化，胚乳發(fā)生一系列理化和生化變化，導(dǎo)致顏色、氣味、糊化特性及微觀結(jié)構(gòu)的改變[1]，使食用品質(zhì)劣變。在顏色上，陳米的胚乳表面整體光澤度下降，呈灰粉狀且有白色溝紋，部分米粒邊緣發(fā)黃甚至有咖啡色；在氣味上，陳米會(huì)出現(xiàn)霉味和酸味等異味；在質(zhì)構(gòu)方面，陳米組織硬化，韌性低，質(zhì)感脆，結(jié)構(gòu)松散，按壓易碎。陳米由于結(jié)構(gòu)變得緊密，糊化中水分難以滲入，造成糊化時(shí)間延長(zhǎng)且米飯黏性下降[2]。即使顏色和氣味不變，糊化特性也會(huì)發(fā)生劣變。越來(lái)越多的研究表明，蛋白質(zhì)的變化與糊化特性變化密切相關(guān)，但是蛋白質(zhì)的氧化變化光譜表征較少。

研究表明，大米陳化后巰基氧化成二硫鍵，谷蛋白平均分子量增加[3]。陳化后清蛋白中α-螺旋減少，脂肪族氨基酸側(cè)鏈被包埋；球蛋白與淀粉相互作用加強(qiáng)，谷蛋白與淀粉的結(jié)合減弱；醇溶蛋白反平行-β折疊結(jié)構(gòu)增加，二硫鍵構(gòu)型改變，酪氨酸殘基更加暴露[4]。吳偉等[5]研究發(fā)現(xiàn)，米糠中游離脂肪酸氧化形成活性脂氧化物，導(dǎo)致谷蛋白氧化和功能性質(zhì)改變?，F(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)大米陳化后谷蛋白結(jié)構(gòu)變化的研究多集中在電泳表征分子量[6]，巰基變化表征二硫鍵氧化[7]，熒光光譜表征芳香族氨基酸殘基微環(huán)境的變化[8]及紅外光譜和圓二色光譜表征二級(jí)結(jié)構(gòu)[9]，對(duì)谷蛋白巰基氧化產(chǎn)物的表征研究較少。分子量的表征主要是通過(guò)電泳法，蛋白質(zhì)常被加熱變性，因此不能確定蛋白質(zhì)的變性是在陳化期間發(fā)生，還是在電泳實(shí)驗(yàn)變性處理時(shí)發(fā)生的。已有報(bào)道缺乏對(duì)谷蛋白單獨(dú)陳化產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化及其對(duì)功能性質(zhì)的影響研究，特別是對(duì)與空氣接觸的富含蛋白的米粒外層中谷蛋白的結(jié)構(gòu)變化研究未見(jiàn)報(bào)道。

米粒中蛋白分布不均，米粒外層蛋白含量高于胚乳內(nèi)部，且大米陳化中米粒外層暴露于空氣中，未見(jiàn)米粒外層中谷蛋白的拉曼和紅外光譜研究。本實(shí)驗(yàn)選用富含蛋白的米粒外層米粉作為原料，采用Osborne法[10]順序提取獲得谷蛋白，表征谷蛋白在陳化前后的結(jié)構(gòu)變化和功能性質(zhì)變化[11]，為闡明蛋白質(zhì)在稻米陳化中的作用，控制陳化以減少糧食產(chǎn)后損失奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和試劑

大米，購(gòu)于蘇果超市，初始含水量14.08%±0.07%。

花生油，益海嘉里糧油股份有限公司；牛血清白蛋白(BR)、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、鹽酸、十二烷基硫酸鈉(SDS)：分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；溴化鉀：光譜純，Merck KGaA Millipore Corporation。

1.2 儀器

稻谷精米檢測(cè)機(jī)(JGMJ8090)，上海嘉定糧油儀器有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(FW-100)，天津泰斯特儀器有限公司；紅外光譜分析儀(FT-IR200)，美國(guó)Nicolet公司；激光共聚焦顯微拉曼光譜儀(HR-800型)，法國(guó)Jobin-Yvon公司；紫外分光光度計(jì)(UV-5800C)，上海元析儀器有限公司；離心機(jī)(L-550)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大米儲(chǔ)藏陳化及谷蛋白提取和陳化

大米儲(chǔ)藏陳化：將新鮮大米分成兩份，分別裝入廣口瓶中密封，一份在4 ℃下貯存保鮮，作為對(duì)照；另一份放置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中儲(chǔ)藏12個(gè)月，獲得陳米[12]。利用稻谷精米機(jī)對(duì)大米進(jìn)行剝蝕碾磨，收集米粒外層15%米粉，過(guò)40目篩，裝入自封口袋中在4 ℃下貯存?zhèn)溆谩?/p>

谷蛋白提取[10]：稱取40 g米粉，加160 mL正己烷在25 ℃脫脂1 h，抽濾，沉淀在室溫?fù)]發(fā)24 h，得脫脂米粉。取40 g脫脂米粉，先用蒸餾水和5% NaCl脫除清蛋白和球蛋白后，再用160 mL 0.1 mol·L-1的NaOH提取谷蛋白1 h，4 000 r·min-1離心10 min，取上清液重復(fù)提取1次。合并兩次上清液靜置6 h，4 000 r·min-1離心10 min，上清液先用1.0 mol·L-1的HCl調(diào)pH至6.0，再用0.1 mol·L-1HCl調(diào)pH至4.8，等電沉淀谷蛋白。靜置沉淀6 h后，4 000 r·min-1離心10 min；沉淀用兩倍蒸餾水洗滌，離心。洗滌后的沉淀用0.1 mol·L-1的NaOH調(diào)pH至7.0，離心，沉淀用2倍蒸餾水洗滌兩次。所得沉淀凍干，得谷蛋白。分別以新米和陳米作為原料，通過(guò)上述方法獲得新米谷蛋白和陳米谷蛋白。

新米谷蛋白的陳化：將上述新米谷蛋白分成兩份，一份在37 ℃下儲(chǔ)藏12個(gè)月(模擬大米儲(chǔ)藏陳化條件)，獲得經(jīng)陳化的新米谷蛋白(陳化谷蛋白)；另一份在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 谷蛋白拉曼光譜分析

谷蛋白的拉曼光譜分析參照Guo[4]的方法，測(cè)定條件：激光波長(zhǎng)514.5 nm，功率20 mW，到達(dá)樣品的光斑直徑約1 μm。測(cè)前，激光波長(zhǎng)在520.7 nm處以單晶硅校正。掃描時(shí)間60 s，掃描波數(shù)范圍200～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1, 樣品掃描速度120 cm-1·min-1，每1 cm-1記錄數(shù)據(jù)。50×長(zhǎng)焦鏡頭(LMP)，在背散射方向收集拉曼信號(hào)，至少3個(gè)不同的樣品點(diǎn)被測(cè)試并記錄。所獲得數(shù)據(jù)采用Omnic 8.0軟件進(jìn)行基線校正、平滑(nine-point Golay-Savitzky procedure)。因?qū)嶋H獲得的拉曼光譜強(qiáng)度不僅與物質(zhì)含量有關(guān)，還受到激光器強(qiáng)度、拉曼探頭與樣品相對(duì)距離、光纖傳輸效率、檢測(cè)器量子效率等其他因素的影響。即使利用高性能拉曼光譜儀，并嚴(yán)格控制測(cè)試條件，也不能保證同一樣品的拉曼強(qiáng)度在平行測(cè)定中不產(chǎn)生差異。因此以苯丙氨酸峰為基準(zhǔn)進(jìn)行歸一化處理進(jìn)行強(qiáng)度校正[4, 13]。

1.3.3 谷蛋白紅外光譜分析

紅外光譜分析采用溴化鉀壓片法[4]：將蛋白粉末與干燥的溴化鉀按1∶100混合后研磨至足夠細(xì)，在壓片機(jī)上以10 T·cm-2壓片，直至得到的壓片均勻無(wú)裂痕呈半透明狀。在紅外光譜儀上掃描，波數(shù)400～4 000 cm-1，分辨率2 cm-1，掃描512次獲得疊加譜，試驗(yàn)重復(fù)3次，譜圖用Omnic 8.0分析。

1.3.4 谷蛋白功能性質(zhì)的測(cè)定

(1)溶解性的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)[14]：取4支試管，各稱取0.010 g谷蛋白樣品，分別加入pH值3，5，7和9的10 mmol·L-1PBS緩沖液1 mL，渦旋振蕩3次，每次3 s，得到不同pH值下的1%蛋白懸液。將蛋白懸液于5 000 r·min-1下離心10 min，取上清液用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)持水性和持油性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[15]，采用重量法測(cè)定：稱取0.100 g谷蛋白樣品于預(yù)先恒重的離心管m1中，加入5 mL蒸餾水(花生油)，渦旋振蕩3次，每次3 s，在40 ℃恒溫水浴中保溫30 min。將混合物在4 000 r·min-1下離心10 min，傾去上清液，稱取離心管質(zhì)量m2。通過(guò)公式：持水性(持油性)(mL·g-1)=(m2-m1-0.100)/0.100，計(jì)算樣品的持水性和持油性。

(3)乳化性和乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[5]用濁度法：稱取0.015 g樣品，分散于15 mL pH 7.4的10 mmol·L-1的PBS緩沖液中，得到1 mg·mL-1谷蛋白懸液，加入5 mL花生油，用高速分散均質(zhì)機(jī)以10 000 r·min-1的速度均質(zhì)2 min。立刻取出20 μL谷蛋白-花生油乳狀液與5 mL 0.1% SDS溶液混合均勻，以0.1% SDS為空白，在500 nm處測(cè)定吸光度(記為A0)。剩下的谷蛋白-花生油乳狀液靜置30 min后，以同樣的方法測(cè)定吸光度(記為A30)。則：乳化性(m2·g-1)=(2×2.303A0N)/(c×φ×10 000)，乳化穩(wěn)定性(min)=A0/(A0-A30)×30，其中N為稀釋倍數(shù)取250(20 μL蛋白-花生油乳狀液與5 mL 0.1% SDS混勻)，c為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(1 mg·mL-1)，φ為油相所占的體積分?jǐn)?shù)(0.25)。

(4)起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[5]：取5個(gè)50 mL燒杯，各稱取0.100 g谷蛋白；向燒杯中分別加入pH值為3，5，7，9和11的0.05 mol·L-1PBS緩沖液各10 mL，得到不同pH值下1%蛋白分散液，用高速分散均質(zhì)機(jī)以10 000 r·min-1的速度均質(zhì)30 s，連續(xù)4次共2 min，均質(zhì)后的泡沫體積記為V0；靜置30 min后再次記錄泡沫體積V30。則：起泡性=(V0-10)/10×100%，泡沫穩(wěn)定性=(V30-10)/(V0-10)×100%。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SAS 8.01進(jìn)行單因素方差分析及鄧肯多重比較[16](Duncan’s Multiple Range Test)，p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 谷蛋白陳化變化的拉曼光譜分析

拉曼光譜適合研究同原子間形成的非極性鍵，能表現(xiàn)出氨基酸側(cè)鏈所處微環(huán)境的變化，從而為蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化提供信息。新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白的拉曼光譜見(jiàn)圖1，拉曼頻率、官能團(tuán)指認(rèn)和歸一化強(qiáng)度見(jiàn)表1。

圖1 陳化后谷蛋白拉曼光譜變化

表1 谷蛋白拉曼光譜特征峰指認(rèn)

由表1可以看出，陳米谷蛋白和陳化谷蛋白在1 665/1 666 cm-1與1 218/1 219 cm-1處的拉曼光譜強(qiáng)度明顯低于新米谷蛋白，此兩峰分別歸屬于酰胺Ⅰ和酰胺Ⅲ帶，說(shuō)明陳米谷蛋白和陳化谷蛋白中α-螺旋明顯減少[17]。在516，527，1 035，1 124，1 152，1 159，1 316和1 334 cm-1處，陳米谷蛋白和陳化谷蛋白的峰強(qiáng)度明顯高于新米谷蛋白，這歸屬于含硫氨基酸殘基的氧化產(chǎn)物——二硫鍵、亞砜和砜，表明陳化后谷蛋白中巰基發(fā)生氧化[17-18]。481，1 451和2 936 cm-1峰均歸屬C—H鍵，陳化前后谷蛋白峰的拉曼強(qiáng)度變化不明顯。857/830 cm-1為酪氨酸的Fermi共振，陳化后谷蛋白峰的強(qiáng)度比明顯增大，說(shuō)明谷蛋白中酪氨酸殘基更加暴露[17, 19]。749/751/755 cm-1為色氨酸吲哚環(huán)的拉曼峰位，陳化后強(qiáng)度提高說(shuō)明谷蛋白色氨酸殘基被埋藏[17-18]。O—H伸縮峰3 423 cm-1在陳化后顯著增強(qiáng)，說(shuō)明分子間鍵合程度升高，谷蛋白與淀粉分子結(jié)合更緊密[19]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果，不管是陳米中的谷蛋白，還是新米谷蛋白被提取出來(lái)后再陳化，α-螺旋結(jié)構(gòu)均明顯減少，含硫氨基酸氧化，酪氨酸殘基更深度暴露，色氨酸殘基更深度埋藏，谷蛋白與淀粉分子之間結(jié)合更為緊密。這些拉曼光譜特征，有力地說(shuō)明了陳化后谷蛋白含硫氨基酸氧化形成二硫鍵、亞砜和砜的存在，以及陳化谷蛋白比陳米谷蛋白氧化程度更高，為稻米陳化劣變中谷蛋白的氧化提供了光譜學(xué)依據(jù)。

2.2 谷蛋白陳化變化的紅外光譜分析

紅外光譜反映分子振動(dòng)-轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)，與振動(dòng)過(guò)程中分子偶極矩的變化相關(guān)，反映分子內(nèi)部的微觀結(jié)構(gòu)，可進(jìn)一步說(shuō)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。從圖2和表2可以看出，陳米谷蛋白在1 153，1 078和1 026 cm-1處的吸收峰明顯增強(qiáng)。1 153 cm-1為砜的特征吸收，1 078和1 027 cm-1為亞砜的特征吸收[20]。三處均表征含硫的氧化產(chǎn)物，說(shuō)明陳化引起了含硫氨基酸殘基的氧化，包括巰基氧化成二硫鍵、亞砜和砜等。谷蛋白在931 cm-1附近出現(xiàn)了較弱的吸收，此為糖環(huán)骨架的特征吸收峰[20]，陳米谷蛋白的此吸收峰強(qiáng)度比新米谷蛋白大，表明陳化后谷蛋白存在糖基化趨勢(shì)，與淀粉分子的結(jié)合更加緊密，可能影響了陳米的糊化特性[21]。

圖2 陳化后谷蛋白紅外光譜變化

表2 谷蛋白紅外特征頻率及歸屬

2.3 陳化對(duì)谷蛋白功能性質(zhì)的影響

2.3.1 陳化對(duì)谷蛋白溶解性的影響

由圖3可知，不同pH值下，陳米谷蛋白的溶解性均明顯低于新米谷蛋白，且在pH 3時(shí)差異最大。陳化谷蛋白的溶解性僅在pH 3時(shí)低于陳米谷蛋白，而在其他pH值下高于陳米谷蛋白，且在pH 9時(shí)比新米谷蛋白更高。這些結(jié)果說(shuō)明，陳化使得谷蛋白的溶解性降低，在酸性條件下尤為明顯，這可能與光譜分析中所示谷蛋白氧化有關(guān)。陳化使更多的疏水基團(tuán)暴露，降低了蛋白質(zhì)溶解性。

圖3 陳化對(duì)谷蛋白溶解性的影響

2.3.2 陳化對(duì)谷蛋白持水性和持油性的影響

由圖4(a)可知，新米谷蛋白的持水性最高，其次是陳米谷蛋白，陳化谷蛋白的持水性最低。而持油性變化趨勢(shì)與持水性正相反[圖4(b)]，新米谷蛋白的持油性最低，陳米谷蛋白其次，陳化谷蛋白的持油性最高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明谷蛋白的陳化降低了持水性，提高了持油性，這一變化支持光譜解析中谷蛋白陳化后疏水基暴露的結(jié)果。新米谷蛋白被提取出來(lái)后單獨(dú)陳化的變化更明顯，表明淀粉對(duì)谷蛋白陳化有一定緩解作用。

圖4 陳化對(duì)谷蛋白持水性(a)和持油性(b)的影響

2.3.3 陳化對(duì)谷蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性影響

由圖5(a)可見(jiàn)，新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白乳化性依次顯著降低；新米谷蛋白的乳化穩(wěn)定性最高，陳米谷蛋白和陳化谷蛋白乳化穩(wěn)定性明顯降低，但二者間差異不明顯[圖5(b)]。乳化性降低與蛋白質(zhì)溶解性降低密切相關(guān)，陳化使蛋白質(zhì)氧化程度加深，疏水基更加暴露，溶解性下降。

圖5 陳化對(duì)谷蛋白乳化性(a)和乳化穩(wěn)定性(b)的影響

2.3.4 陳化對(duì)谷蛋白起泡性和泡沫穩(wěn)定性影響

由圖6可見(jiàn)，在pH 3和pH 11時(shí)，新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白起泡性依次顯著降低；在其他pH下也呈下降趨勢(shì)，但變化不顯著。起泡性是蛋白質(zhì)分散于界面成薄的能力，起泡性降低，說(shuō)明其分散能力下降，顯示了陳化導(dǎo)致的蛋白質(zhì)氧化引起的溶解性降低。由圖7可知，在各pH值下，泡沫穩(wěn)定性變化不明顯，說(shuō)明谷蛋白的陳化變化對(duì)泡沫穩(wěn)定性影響不顯著。

圖6 陳化對(duì)谷蛋白起泡性的影響

圖7 陳化對(duì)谷蛋白泡沫穩(wěn)定性的影響

3 結(jié) 論

比較了新米谷蛋白、陳米谷蛋白和陳化谷蛋白的拉曼和紅外光譜及三種谷蛋白功能性質(zhì)變化，發(fā)現(xiàn)陳米谷蛋白和陳化谷蛋白比新米谷蛋白的α-螺旋減少，含硫氨基酸殘基氧化產(chǎn)物增多，酪氨酸殘基更加暴露，色氨酸殘基更加埋藏，分子間結(jié)合程度更高，說(shuō)明陳化中谷蛋白發(fā)生了氧化，并體現(xiàn)在蛋白功能性質(zhì)變化上。陳米谷蛋白溶解性、持水性、乳化性和乳化穩(wěn)定性均比新米谷蛋白低，而持油性比新米谷蛋白高，支持谷蛋白在陳化中發(fā)生的氧化變化。陳化谷蛋白溶解性(除pH 9)、持水性和乳化性比陳米谷蛋白更低，持油性更高，說(shuō)明提取出來(lái)的新米谷蛋白單獨(dú)陳化氧化程度更深。可見(jiàn)，通過(guò)拉曼和紅外光譜能很好地表征大米陳化過(guò)程中米粒外層中谷蛋白的氧化，與蛋白功能性質(zhì)的變化相一致，說(shuō)明了稻米陳化劣變的內(nèi)在原因，這為控制稻米陳化劣變、減少產(chǎn)后損失提供了依據(jù)。