黃云霞，孟志娟，趙麗敏，牛立沙，孫文毅，王東

河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室（石家莊 050000）

枸杞為藥食同源食物，富含多糖、氨基酸、多種微量元素等，具有很高的藥用價值和保健功效[1]，廣受國內外消費者喜愛。枸杞為方便運輸和儲存，多以枸杞干果在市場流通，出口到韓國、美國和歐盟等。然而枸杞在種植過程中易遭受多種病蟲害，為保障產量和品質，噴灑農藥是一種常用的有效手段[2]。但由于農藥的不規(guī)范使用，近年來農藥殘留問題成為中國枸杞出口的主要技術性貿易壁壘[3]，因而建立枸杞中多農藥殘留快速準確檢測的方法可以為中國控制枸杞中農藥殘留污染提供有力保障。

農藥殘留檢測常用的前處理方法有固相萃取法[4-6]、分散固相萃取法[7-9]、凝膠滲透色譜法[10-12]、固相微萃取法[13-14]和QuEChERS法[15-17]等。QuEChERS法相比一些傳統(tǒng)樣品制備方法具有前處理時間短、試劑消耗量少等優(yōu)勢，常用于農殘測定中。m-PFC柱是基于QuEChERS法開發(fā)的一種新型快速濾過型凈化柱，含有多壁碳納米凈化填料，具有高穩(wěn)定性和高吸附容量的特點，凈化能力優(yōu)異。此外，m-PFC柱采用注射器式設計，凈化過程省時省力。m-PFC柱被用于人參[18]、茶葉[19]中多農藥殘留測定，尚未見用于枸杞中農殘測定。此外，GB 23200.113—2018《食品安全國家標準 植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定 氣相色譜-質譜聯(lián)用法》中采用QuEChERS法對含水果蔬進行前處理，未涉及枸杞干果的前處理方法。因此，試驗通過優(yōu)化提取條件，經m-PFC柱凈化，結合GC-MS/MS，建立枸杞中75種農藥殘留同時檢測的方法，旨在為快速、準確檢測枸杞中的農藥多殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；醋酸（分析純，天津市光復科技發(fā)展有限公司）；QuEChERS凈化管（簡單基質）2 mL，離心管包括150 mg MgSO4、50 mg PSA（美國Thermo公司）；QuEChERS凈化管（復雜基質）2 mL，離心管包括150 mg MgSO4、50 mg PSA、50 mg C18、50 mg GCB（美國Thermo公司）；m-PFC柱，包括150 mg MgSO4、15 mg PSA和25 mg MWCNTs（北京綠綿科技有限公司）；普通鹽包，包括6 g MgSO4和1.5 g NaCl（美國Thermo公司）；乙酸鈉緩沖鹽包，包括6 g MgSO4和1.5 g醋酸鈉（北京綠綿科技有限公司）；0.22 μm微孔濾膜（天津博納艾杰爾科技公司）。

75種農藥標準品（純度均≥95%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司）。

以乙腈配制75種農藥混合標準儲備液，農藥質量濃度均為10 μg/mL，置于-18 ℃冰箱儲存。

枸杞干果樣品（市售）。

1.2 儀器與設備

GCMS-TQ8050氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀、SH-Rxi-5Sil MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm× 0.25 μm）（日本島津公司）；BCD-576WDPU冰箱（青島海爾股份有限公司）；VM200旋渦振蕩儀（托摩根生物科技有限公司）；3K15型冷凍離心機、1-14K型冷凍離心機（德國Sigma公司）。

1.3 前處理方法

1.3.1 提取

稱取5.0 g（精確到0.001 g）粉碎好的樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL純水渦旋混勻，靜置30 min，加入15 mL 1%（V/V）乙酸-乙腈溶液，充分混勻，渦旋2 min，加入乙酸鈉緩沖鹽包，劇烈振蕩1 min，在9000 r/min下離心3 min，上清液待凈化。

1.3.2 凈化

1.3.2.1 QuEChERS凈化

移取2 mL提取液于QuEChERS凈化管中，旋渦振蕩2 min，按9000 r/min離心3 min，上清液過0.22 μm有機濾膜，進GC-MS/MS分析。

1.3.2.2 m-PFC凈化

移取2 mL提取液于m-PFC凈化柱中，凈化柱底端連接0.22 μm有機濾膜，置于進樣小瓶上方，緩慢推動注射桿，即得待測液，進GC-MS/MS分析。

1.4 標準溶液的配制

空白基質溶液：稱取5 g（精確至0.001 g）空白樣品按照1.3.1小節(jié)進行提取，提取液經m-PFC柱凈化即得空白基質溶液，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

基質混合標準工作液：用空白基質溶液稀釋75種農藥混合標準儲備液（10 μg/mL），配制質量濃度分別為0.001，0.002，0.003，0.005，0.010，0.050，0.100和0.200 μg/mL的系列基質混合標準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 儀器條件

1.5.1 色譜條件

進樣口溫度250 ℃。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持1 min，以25 ℃/min升溫至125 ℃，以10 ℃/min升溫至300 ℃，保持15 min。載氣，氦氣（純度≥ 99.999%）；流速1.69 mL/min；進樣方式，不分流進樣，進樣體積1 μL。

1.5.2 質譜條件

離子源為EI源，溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子能量70 eV；碰撞氣采用氬氣（純度≥99.999%）；監(jiān)測方式采用MRM模式。農藥質譜參數(shù)可從儀器帶有的農殘數(shù)據(jù)庫中獲得，故未列出。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優(yōu)化

依據(jù)國家抽檢和相關標準規(guī)定的農殘檢測項目，結合農產品種植過程中常使用的農藥，選擇75種農藥為研究對象，農藥極性差異較大，而乙腈溶解性好、通用性較強，對大多數(shù)農藥的提取效率高，所以采用乙腈提取。GB 23200.113—2018規(guī)定含水果蔬的農殘?zhí)崛》椒ǎ⑽瓷婕拌坭礁晒?。試驗比較不加水浸泡直接用乙腈提取和加水浸泡后再用乙腈提取對75種農藥回收率的影響。結果顯示，添加水平0.1 mg/kg時，加水提取組回收率在70%～120%的農藥數(shù)量，多于不加水提取組（如表1所示），說明對于枸杞干果樣品，加水浸泡后，農藥更容易轉移出來，提取更加充分，優(yōu)于直接用乙腈提取。

表1 不同提取方式（不加水和加水）對75種農藥回收率的影響

此外，仍有部分酸堿不穩(wěn)定農藥甲胺磷、敵敵畏、氧樂果、滅線磷、治螟磷、甲拌磷、樂果、百菌清、三氯殺螨醇、吡唑醚菌酯、丙溴磷、三唑磷回收率在45.3%～69.5%之間，相對標準偏差為13.2%～ 23.6%。為改善回收率和精密度，加水浸泡后，用1%（V/V）乙酸乙腈溶液提取，再加入乙酸鈉緩沖鹽包，使提取液的pH穩(wěn)定在5～6，防止農藥分解。結果發(fā)現(xiàn)，75種農藥回收率均在70%～120%，相對標準偏差均小于10%。因而后續(xù)試驗選用加水浸泡后再加入1%（V/V）乙酸乙腈和乙酸鈉組成的緩沖體系進行提取。

2.2 QuEChERS凈化與m-PFC凈化的比較

枸杞基質較為復雜，為準確定性定量，需對提取液進行凈化。試驗考察在0.1 mg/kg添加水平下2種QuEChERS凈化管和m-PFC柱分別對枸杞提取液的凈化效果（見圖1）和農藥回收率的影響。QuEChERS凈化管（簡單基質）中含有PSA，PSA分子中含有2個胺基，可與樣品中的有機酸、糖類和部分色素等極性化合物形成氫鍵，達到除雜目的。但PSA吸附色素能力有限，凈化后提取液顏色依然較深，75種農藥的回收率為73.2%～119.2%。QuEChERS凈化管（復雜基質）中含有的GCB凈化材料對色素有強大的吸附作用，提取液凈化后幾乎無色；但GCB會吸附具有平面結構的農藥，如菊酯類農藥，導致部分農藥的回收率低于70%（見表2）。m-PFC柱中含有PSA和多壁碳納米管（MWCNTs）凈化填料。MWCNTs是一種納米級中空材料，具有高比表面積、優(yōu)異的耐酸堿能力和耐熱能力。因其結構特殊，所以對樣品中色素、有機酸、糖類、脂肪酸等吸附能力提高，還能減少對具有苯并雜環(huán)類結構的農藥的吸附問題，如表2所示。m-PFC柱凈化后，提取液顏色明顯變淺，75種農藥回收率在71.1%～117.4%之間，滿足試驗要求。此外，m-PFC柱采用注射器式設計，凈化過程不需旋渦振蕩和離心，比QuEChERS凈化管操作更加簡便。綜合凈化效果和提取效率，后續(xù)試驗選取m-PFC柱凈化。

圖1 經不同凈化方式處理后枸杞提取液顏色的比較

表2 QuEChERS凈化管（復雜基質）和m-PFC柱凈化對部分農藥回收率的比較（n=6）

2.3 基質效應

農藥殘留測定中，普遍存在基質效應。枸杞中含有色素、糖類、有機酸等物質，可以與待測目標物共提取，與目標物在色譜柱上共流出時影響目標物的離子化效應[20]，從而影響檢測的準確性和重復性?；|效應的相對強度（ME）[21]計算見式（1）。配制0.05 μg/mL的基質標準溶液和同等體積分數(shù)的乙腈標準溶液，重復測定3次，結果發(fā)現(xiàn)m-PFC柱凈化后，毒死蜱、三唑酮、甲基異柳磷等21種農藥基質效應在86.3%～114.8%之間，基質效應不明顯，其余農藥均存在不同程度的基質增強效應，ME在115%～140%之間。因此，為保證定量結果的準確性，試驗中配制基質混合標準工作液進行定量分析。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

按照1.4小節(jié)配制質量濃度為0.001～0.2 μg/mL的系列基質混合標準工作液上機分析，結果見表3。各目標化合物在相應線性范圍內相關系數(shù)（R2）為0.9952～ 0.9998。向空白枸杞樣品中添加標準溶液，以信噪比（S/N）約3和10時的空白樣品添加濃度計算方法的檢出限和定量限，結果分別為0.001～0.01 mg/kg和0.003～ 0.03 mg/kg。

2.5 回收率和精密度

為考察方法準確性，選取空白枸杞樣品，進行添加回收試驗，考察在0.03，0.15和0.30 mg/kg添加水平下75種農藥的回收率和精密度，每個水平平行測定6次，結果見表3。在不同添加水平下，方法的平均回收率在72.7%～119.7%之間，相對標準偏差（SRSD）為3.1%～9.8%，表明方法準確度較高，精密度良好，能夠滿足檢測要求。

表3 枸杞中75種農藥的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率和相對標準偏差（n=6）

接表3

2.6 實際樣品的測定

用建立的分析方法對市售50例樣品進行檢測，其中陽性樣品22例，涉及異丙威、毒死蜱、三唑酮、三唑醇、戊唑醇、炔螨特、聯(lián)苯菊酯、氯氟氰菊酯、噠螨靈、氯氰菊酯、苯醚甲環(huán)唑11種農藥，質量分數(shù)在0.028～0.467 mg/kg之間。其中，氯氟氰菊酯、噠螨靈和氯氰菊酯檢出最大值分別為0.028，0.149和0.218 mg/kg，均小于GB 2763—2019規(guī)定的最大殘留限量0.1，3和2 mg/kg，其余檢出農藥均未規(guī)定最大殘留限量。圖2為部分檢出農藥的MRM色譜圖。由圖2可知，該分析方法測定枸杞中農藥殘留時，目標物峰無干擾，可準確定性和定量。

圖2 部分檢出農藥的多反應監(jiān)測色譜圖

3 結論

采用加水浸泡，用1%（V/V）乙酸乙腈溶液與乙酸鈉組成的緩沖體系提取，經m-PFC柱凈化，結合GC-MS/MS，建立枸杞中75種農藥殘留的快速分析方法，并運用到實際樣品檢測中。采用m-PFC柱凈化，操作簡便，節(jié)約前處理時間，該方法在保證試驗結果準確度和精密度的前提下大幅提升檢測效率。試驗方法為枸杞中多農藥殘留進行快速定性定量分析提供技術參考。