余科義，徐禮龍，畢靜

1. 河南應(yīng)用技術(shù)職業(yè)學(xué)院（鄭州 450042）；2. 固始縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心（信陽(yáng) 465200）

海藻是海產(chǎn)藻類(lèi)的統(tǒng)稱(chēng)，雖然是海洋中的低等生物，卻是海洋中有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物資的主要生產(chǎn)者。海藻除富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)和ω-3系列不飽和脂肪酸以外，還可生成獨(dú)有的代謝性化合物（褐藻多酚、巖藻黃質(zhì)等）[1-2]。大葉海藻屬馬尾藻科，是海藻中一種生長(zhǎng)在淺海區(qū)域的品種，能夠進(jìn)行充分的光合作用與生物代謝活動(dòng)，在藥理活性上，具有降血脂、抗氧化、抗菌、增強(qiáng)免疫力等的功效，可作為營(yíng)養(yǎng)品、化妝品、功能性食品及潛在藥物資源等進(jìn)行應(yīng)用和開(kāi)發(fā)，提高海藻的資源化優(yōu)勢(shì)[3-4]。

金屬螯合親和層析技術(shù)（MCAC）是近年來(lái)出現(xiàn)的主要針對(duì)生物大分子分離純化的一種新型親和層析技術(shù)，一般層析介質(zhì)的結(jié)構(gòu)由固相基質(zhì)、螯合配基、金屬離子組成，可用于蛋白質(zhì)的分離純化、活性酶的純化及核苷酸的純化等。尤其在蛋白質(zhì)方面的應(yīng)用，MCAC除了能夠分離純化以外，還可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的識(shí)別和鑒定、蛋白質(zhì)的定向固定及蛋白質(zhì)的復(fù)性純化。因而在生物科技及醫(yī)學(xué)檢測(cè)中尤為重視[5-6]。試驗(yàn)擬用Ni2+螯合海藻中的抗氧化多肽后經(jīng)親和層析柱分離提取，從而保證抗氧化多肽的高純度和優(yōu)良的活性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

大葉海藻（正禾生物科技有限公司）；NaHCO3（濟(jì)南明星化工有限公司）；丁醇（山東諾爾化工有限公司）；IDA（湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司）；殼聚糖（南京松冠生物科技有限公司）；CH3COOK（廣州三鑫化工有限公司）；span 60（江蘇海安石油化工廠）；Na2S2O3（鄭州欣茂化工產(chǎn)品有限公司）；CH3COOH（南京化學(xué)試劑股份有限公司）；NiSO4（武漢宏信康精細(xì)化工有限公司）；NH4Cl、NH3·H2O（太原安業(yè)化工有限公司）。

JFM-12細(xì)胞破壁機(jī)（濟(jì)南健辰機(jī)械有限公司）；DT-5離心機(jī)（廣東佛衡儀器有限公司）；索式提取器（上海歡奧科技有限公司）；LYZ-111B培養(yǎng)搖床（上海新諾儀器設(shè)備有限公司）；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（愛(ài)來(lái)寶醫(yī)療科技有限公司）。

1.2 大葉海藻的預(yù)處理

將大葉海藻進(jìn)行細(xì)胞壁破碎后浸于5% NaHCO3溶液2 d，抽濾留取沉淀物，參照文獻(xiàn)[7]對(duì)沉淀物進(jìn)行甲酯化處理后離心脫去。剩余的沉淀物置于丁醇溶劑中進(jìn)行浸提，采用索式提取器重復(fù)3次對(duì)浸提液純化，得到大葉海藻的多肽粗提取液。

1.3 Ni2+螯合親和層析柱的制備[8]

選用IDA-殼聚糖作為層析柱填料。對(duì)殼聚糖進(jìn)行預(yù)處理，將殼聚糖溶解于5%的CH3COOK溶液中，加入2 mL span60和20 mL Na2S2O3溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%）。形成殼聚糖微球后在50 ℃恒溫水浴中加入CH3COOH溶液脫除Na2S2O3。離心沉淀后取出沉淀微球，并置于氯仿中浸泡2 h，乙醇清洗并去離子水洗后與IDA在搖床中反應(yīng)生成IDA-殼聚糖微球。將此IDA-殼聚糖微球填料裝柱，用0.1 mol/L的NiSO4水溶液充分沖流整個(gè)柱體，使得Ni2+被充分吸附于IDA-殼聚糖填料。采用約pH 8.0的NH3·H2O-NH4Cl緩沖溶液平衡層析柱的酸堿性，使之維持在弱堿性環(huán)境狀態(tài)。

1.4 Ni2+與多肽的螯合親和層析

用緩沖溶液NH3·H2O-NH4Cl調(diào)節(jié)多肽粗提取液至與層析柱pH相近，勻速將粗提取液倒入層析柱上端，靜置等待樣品與Ni2+在層析介質(zhì)上充分結(jié)合[9]。采用緩沖溶液NH3·H2O-NH4Cl快速洗脫得到分離液，用不同洗脫劑洗脫，洗脫流速控制在2 mL/min，每5 min收集一批洗脫液，將收集的洗脫液再倒入層析柱中反復(fù)洗脫3次，得到的洗脫樣品在240 nm下測(cè)定吸光度以判斷多肽濃度高低。

1.5 試驗(yàn)中的相關(guān)測(cè)定

鎳含量的測(cè)定：參照文獻(xiàn)[10]，采用乙二胺四乙酸滴定法進(jìn)行滴定，計(jì)算得出鎳含量。并根據(jù)式（1）計(jì)算出鎳與抗氧化多肽的螯合率。

式中：m1為鎳的加入量，g；m2為鎳與抗氧化多肽形成的螯合物質(zhì)量，g；c為鎳含量，%。

抗氧化多肽的乳化活性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[11]，將抗氧化多肽與不同pH的緩沖溶液配制成0.2%的抗氧化多肽溶液。加入1.0 mL植物油混合混勻后，吸取底部溶液與SDS溶液混合，測(cè)得的最大吸光度計(jì)為乳化活性。

抗氧化多肽對(duì)超氧負(fù)離子的清除能力：參照文獻(xiàn)[12]，采用鄰苯三酚法。將不同濃度的抗氧化多肽經(jīng)水浴30 ℃加熱30 min后，加入Tris-HCl緩沖溶液和鄰苯三酚溶液靜置比色。紫外分光光度計(jì)每5 min測(cè)定1次最大吸光度，繪制最大吸光度變化曲線，經(jīng)擬合處理，其斜率為抗氧化多肽清除·速率。

抗氧化多肽對(duì)羥自由基的清除能力：參照Fenton檢測(cè)法[13]，在試管中加入抗氧化多肽、FeSO4溶液、H2O2溶液，搖勻后靜置15 min，加入水楊酸溶液，靜置后于480 nm波長(zhǎng)處測(cè)其最大吸光度，并根據(jù)式（3）計(jì)算羥自由基的清除率。

式中：A0為空白對(duì)照試驗(yàn)組吸光度；A1為試驗(yàn)組吸光度；A2為不添加水楊酸的試驗(yàn)組吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同洗脫劑對(duì)抗氧化多肽在親和層析柱上的洗脫影響

圖1為4種不同洗脫劑在濃度均為0.01 mol/L情況下的最大洗脫值對(duì)比圖，可以明顯看出，吡啶和甲酸鈉洗脫效果較差，且會(huì)影響層析柱的pH環(huán)境。NaH2PO4和Na2HPO4的洗脫效果較好，其中，NaH2PO4不僅洗脫效果最好，而且與抗氧化多肽的活性pH范圍相近，因而試驗(yàn)選用NaH2PO4溶液作為洗脫劑。

圖1 幾種洗脫劑的洗脫效果對(duì)比柱形圖

2.2 抗氧化多肽的洗脫純化

在Ni2+螯合親和層析柱中加入大葉海藻多肽粗提液后，層析柱的洗脫曲線如圖2所示。采用緩沖溶液洗脫得到的第1個(gè)峰為雜質(zhì)洗脫峰，第2個(gè)峰為利用NaH2PO4溶液作為洗脫劑進(jìn)行洗脫的特異性洗脫峰?？梢钥闯?個(gè)峰之間的間距時(shí)間較長(zhǎng)，這樣有利于雜質(zhì)的脫去而使得多肽的純化效率提升，純化效果提高。具體的抗氧化性多肽的純化效率如表1所示。

圖2 蛋白質(zhì)的洗脫曲線

表1 抗氧化多肽的純化效率

2.3 抗氧化多肽-Ni螯合物的組成及螯合率分析

抗氧化多肽與Ni-IDA-殼聚糖-span60形成的螯合物組成成分含量及螯合率測(cè)定結(jié)果如表2所示?？寡趸嚯呐cNi的含量較高，總占比達(dá)86.2%，其他成分則包含span60、灰分、鈉鉀鹽等。螯合率超過(guò)70%，表明親和層析柱對(duì)抗氧化多肽的吸附作用明顯，后續(xù)洗脫工藝可以得到純度較高的抗氧化多肽。

表2 螯合物的組成及螯合率測(cè)定結(jié)果

2.4 層析柱的pH環(huán)境對(duì)抗氧化多肽乳化活性的影響

層析柱的酸堿性對(duì)抗氧化多肽的乳化活性影響變化如圖3所示。在乳化活性測(cè)定試驗(yàn)中，多肽被吸附于油-水交界面形成微膜，多肽鏈端的羧基可與油相互相作用，而氨基則與水相互相作用，從而平衡油-水交界處的平衡，此時(shí)利于乳化性能的提升。因此，抗氧化多肽在不同pH環(huán)境下的羧基基團(tuán)和氨基基團(tuán)數(shù)量決定著乳化活性。從圖3可以看出，乳化活性在弱堿性條件下較為活躍，所以試驗(yàn)中的層析柱pH也應(yīng)處在弱堿性范圍內(nèi)。

圖3 層析柱的pH對(duì)抗氧化多肽乳化活性的影響曲線

2.5 大葉海藻抗氧化多肽的抗氧化活性分析

圖4 抗氧化多肽質(zhì)量濃度對(duì)O2-·清除率的關(guān)系曲線

2.5.2 對(duì)·OH的清除能力

不同質(zhì)量濃度的抗氧化多肽對(duì)·OH的清除率測(cè)定結(jié)果如圖5所示。大葉海藻中提取出來(lái)的抗氧化多肽對(duì)·OH的清除率隨著其質(zhì)量濃度增加而呈現(xiàn)清除率迅速增大的趨勢(shì)。推測(cè)為抗氧化多肽的鏈段中存在著能與·OH發(fā)生二級(jí)反應(yīng)的基團(tuán)，故初始抗氧化多肽質(zhì)量濃度較低時(shí)引發(fā)的·OH遷移速率較慢，一級(jí)反應(yīng)的終產(chǎn)物濃度提升時(shí)，決定整個(gè)反應(yīng)速率的二級(jí)反應(yīng)才會(huì)顯著加快，提高對(duì)·OH的捕捉能力，因而對(duì)·OH清除能力在抗氧化多肽質(zhì)量濃度大于10 μg/mL時(shí)明顯增強(qiáng)。

圖5 抗氧化多肽質(zhì)量濃度對(duì)·OH清除率的關(guān)系曲線

3 結(jié)論

以大葉海藻為原料，采用Ni2+離子親和層析柱擬對(duì)海藻中的抗氧化多肽進(jìn)行分離純化。多肽與Ni2+形成螯合物后，吸附于IDA-殼聚糖-span60組成的層析柱中，經(jīng)洗脫劑NaH2PO4溶液洗脫后即得純化的抗氧化多肽溶液。比對(duì)幾種洗脫劑的洗脫效果，NaH2PO4不僅洗脫效果最好，而且與抗氧化多肽的活性pH范圍相近?？寡趸嚯?Ni螯合物經(jīng)分析由抗氧化多肽、Ni、IDA-殼聚糖和其他成分組成，抗氧化多肽與Ni總占比86.2%，而螯合率也超過(guò)70%。層析柱經(jīng)緩沖溶液調(diào)節(jié)約pH 8.5時(shí)分離純化效果最佳。洗脫過(guò)程中的洗脫曲線會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)洗脫峰和多肽洗脫峰，2個(gè)峰之間的間距時(shí)間較長(zhǎng)，說(shuō)明層析柱將雜質(zhì)與多肽互相分離的程度較高。試驗(yàn)還對(duì)抗氧化多肽的抗氧化能力進(jìn)行探討，抗氧化多肽質(zhì)量濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，對(duì)O2-· 和·OH的清除率分別達(dá)到91.8%和96%，此時(shí)多肽的抗氧化活性較高。