王 悅 孟湃喆 于艷紅▲

1.沈陽市第十人民醫(yī)院結(jié)核病實驗室，遼寧沈陽 110044；2.沈陽市醫(yī)學院醫(yī)學檢驗技術(shù)專業(yè)，遼寧沈陽 110034

結(jié)核?。╰uberculosis，TB）位居全球單一致死性傳染病的首位，每年約有50 萬利福平耐藥病例，其中78%為耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）[1]。我國是全球耐藥結(jié)核病負擔最大的三個國家之一[2-3]。由于傳統(tǒng)的藥敏試驗方法費時、繁瑣，無法滿足快速臨床診斷的要求[4-5]，許多快捷高效的分子技術(shù)已更多應用于TB 檢測，包括熒光PCR熔解曲線法、線性探針耐藥檢測法或DNA 微陣列等。熒光PCR熔解曲線技術(shù)特點是在擴增完成后增加了熔解曲線的分析過程，比較樣本與陽性對照間熔點差異（△Tm值）。該技術(shù)對rpoB基因與利福平耐藥相關(guān)81bp 進行突變檢測；對與異煙肼耐藥相關(guān)的ahpC啟動子、inhA94 密碼子、inhA啟動子以及katG315 密碼子的相關(guān)位點進行特異檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 回顧性分析2019年7月—2020年7月沈陽市第十人民醫(yī)院收取的254 例痰樣本檢驗結(jié)果，三項檢測為同一患者的同一樣本，排除標準為治療超過2 周的患者。以MGIT 960 藥敏試驗為參考標準，探討熔解曲線技術(shù)在結(jié)核病耐藥診斷中的應用價值，并采用線性探針耐藥檢測技術(shù)對不一致結(jié)果進行復檢。本研究經(jīng)過沈陽市第十人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.1.2 主要儀器及試劑 Bio-Rad CFX96 實時熒光PCR 擴增儀（Bio-Rad Laboratories）；Lab-Aid 824 核酸提取儀、結(jié)核分枝桿菌利福平/異煙肼耐藥突變檢測試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司）；MGIT 960 全自動結(jié)核分枝桿菌快速培養(yǎng)法儀及配套試劑（Becton，Dickinson and Company）；全自動核酸印記微生物檢測系統(tǒng)（GTGBlot 48）及配套試劑（法國生物梅里埃股份有限公司）。

1.2 方法

收集254 例痰樣本檢驗結(jié)果，熔解曲線法與MGIT 960 藥敏試驗不一致的結(jié)果應用世衛(wèi)組織推薦的線性探針耐藥檢測法進行復檢，三種方法如下。

MGIT960 藥敏試驗：痰標本前處理按照《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[6]規(guī)定進行，完成接種后，進行培養(yǎng)，儀器報陽后對培養(yǎng)物進行抗酸染色鏡檢確認，陽性者進入藥敏試驗。

熔解曲線法前處理：取培養(yǎng)法前處理液化完成的痰液1.5 mL，高速離心后棄上清并加入TB DNA 提取液重懸沉淀，滅活后進行核酸提取、配液、擴增等工作流程。檢驗結(jié)果是通過四個通道的樣品與陽性對照之間熔解曲線熔點（Tm）的差異判斷樣品是否發(fā)生突變，熔點均一致（誤差不超過1℃）時判定為野生型（敏感）；四個通道中任意通道中樣品的熔點低于陽性對照2℃判定為突變型（耐藥）。

線性探針耐藥檢測法：標本處理按照法國生物梅里埃的試劑盒說明書進行，包括DNA 提取、擴增、雜交、制備流程。判讀標準為野生條帶均顯色且突變條帶無顯色時為敏感，野生條帶有缺失或突變條帶顯色為耐藥。

1.3 統(tǒng)計學方法

所有檢測結(jié)果、患者基本信息采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。以MGIT 960 藥敏試驗結(jié)果為參考標準，計算熔解曲線法檢測的敏感性、特異性、一致性、陽性預測值（positive predictive value，PPV）、陰性預測值（negative predictive value，NPV）和Kappa值以及對MDR-TB 結(jié)果的判定能力。敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陰性）例數(shù)×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陽性）例數(shù)×100%；PPV=真陽性例數(shù)/（真陽性+假陽性）例數(shù)×100%；NPV=真陰性例數(shù)/（真陰性+假陰性）例數(shù)×100%；一致性=（真陽性+真陰性）/（真陽性+假陽性+真陰性+假陰性）例數(shù)×100%；Kappa值≥0.75 表示兩者一致性較好；0.4≤Kappa＜0.75 表示兩者一致性一般；Kappa＜0.4 表示兩者一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 基本情況

收集的254 例患者信息顯示，初治患者166 人（65.4%）；年齡18～88 歲，平均（52±14.6）歲；41～60年齡段人數(shù)為123 人（48.4%），男性199 人（78.3%）。

2.2 藥敏結(jié)果

在利福平藥敏試驗結(jié)果中，熔解曲線法的敏感性、特異性分別為89.6%、95.6%，Kappa值≥0.75，與參考標準一致性較好；兩種檢測技術(shù)共有14 例不一致。在異煙肼藥敏試驗結(jié)果中，熔解曲線法的敏感性、特異性分別為81.5%、98.9%，Kappa值≥0.75，與參考標準一致性較好；兩種檢測技術(shù)共有14 例不一致（表1）。

表1 熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥與MGIT 960 藥敏試驗結(jié)果的比較（例數(shù)）

2.3 應用線性探針耐藥檢測技術(shù)對不一致結(jié)果進行復檢

254 例藥敏結(jié)果中，熔解曲線共有28 例結(jié)果與參考標準不同。其中有17 例是熔解曲線法顯示敏感，而MGIT 960 藥敏試驗為耐藥，線性探針耐藥檢測復檢為12 例耐藥，5 例敏感；有11 例是熔解曲線法顯示耐藥，而MGIT 960 藥敏試驗為敏感，線性探針耐藥檢測復檢為3 例敏感，8 例耐藥。

2.4 熔解曲線法檢測MDR-TB 的效能

檢測所有病例MDR-TB 的能力與參考標準比較，熔解曲線法的敏感性、特異性分別為80.5%、95.8%，Kappa值為0.76，二者一致性較好。初治患者的敏感性和特異性均高于復治患者，其Kappa值為0.93，優(yōu)于復治患者的0.60（表2）。

表2 熔解曲線法對不同治療史樣本患者MDR-TB 結(jié)果的判定（例數(shù)）

3 討論

與MGIT960 藥敏法比較，熒光PCR熔解曲線法對兩種藥物的耐藥檢測指標較好，但是異煙肼耐藥檢測的敏感性略低于利福平，可能是由于利福平耐藥突變的檢測限略高的原因。關(guān)于不一致結(jié)果的產(chǎn)生原因較復雜，MGIT 960 藥敏法耐藥而熔解曲線法敏感的可能原因：①分子法是針對特定突變位點的密碼子的檢測，不能覆蓋所有的突變位點；②耐藥機制除了位點突變還存在外排泵[7-8]等；③可能存在異質(zhì)性耐藥[9]，一般分子法的檢測限在20%左右，而培養(yǎng)法的檢測限可達到1%[10]。MGIT 960 藥敏法敏感而熔解曲線法檢測耐藥的可能原因：①體外培養(yǎng)可能導致耐藥菌亞群比例下降、低于培養(yǎng)法檢測靈敏度[11]；②異質(zhì)性耐藥或DNA 純度不夠，導致熔解曲線出現(xiàn)各種雜合峰或復雜曲線，受到儀器性能和人工判讀的影響較大[12]；③可能與MGIT 960 藥敏法的利福平終濃度設置過高有關(guān)（培養(yǎng)管中的藥物終濃度為利福平1.0 μg/mL，異煙肼0.1 μg/mL）；④分子藥敏檢測出rpoB基因511位點和inhA突變時，表型藥敏往往檢測結(jié)果為陰性[13]。參考《結(jié)核分枝桿菌耐藥性監(jiān)測專家共識》[14]的建議，當分子藥敏試驗和表型藥敏試驗結(jié)果不一致時，需參考對不同抗結(jié)核藥品分子藥敏試驗檢測敏感度和特異度[15]。

應用線性探針耐藥技術(shù)對不一致結(jié)果的復檢顯示，在利福平耐藥檢測方面，線性探針更傾向于與參考標準一致，由于是對不一致結(jié)果進行復檢，不能以與參考標準結(jié)果符合度高更多而斷定線性探針方法優(yōu)于熔解曲線法。我國對異煙肼耐藥的菌株中約有3%攜帶axyR-ahpC基因突變[16]，與線性探針比較，是熔解曲線法的檢測優(yōu)勢，所以復檢指標中線性探針與參考指標比較的符合度低于利福平。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不一致結(jié)果中抗酸染色鏡檢3+以上即菌量較多標本，兩種分子法一致且都與參考標準不同，這很可能與異質(zhì)性耐藥和檢測限有關(guān)。

對于MDR-TB 的判定，熔解曲線法更適用于初治人群，這可能是由于：①復治患者治療過程中藥物選擇作用下產(chǎn)生的突變并不引起氨基酸改變；②復治患者在治療中出現(xiàn)的耐藥突變更為復雜，超出了分子法檢測突變的范圍[17]。本實驗的不足在于沒有對不一致結(jié)果進行測序，可以在未來的研究中進一步驗證。

綜上所述，熒光PCR熔解曲線法實現(xiàn)了模塊封閉性自動化檢測，雖然無法取代表型藥敏技術(shù)，但是其快速、準確的特點，仍適用于結(jié)核病耐藥初篩，MDR-TB 患者可以通過盡快原則適當?shù)剡M行二線藥物快速治療，取得更好的療效。