張?chǎng)?丁敬坤 李加琦 薛素燕 蔣增杰 方建光 毛玉澤①

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省漁業(yè)資源與生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266237)

隨著經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，工業(yè)生產(chǎn)，如有色金屬冶煉、煤炭燃燒和電子垃圾處理等產(chǎn)生的重金屬通過(guò)地表徑流等方式大量輸入近海，并在輸送過(guò)程中不斷沉積，成為沿海海域的主要污染物(Zarykhtaet al, 2019;Zhanget al, 2017)。我國(guó)近海河口環(huán)境Cu 污染水平在過(guò)去幾十年中呈逐漸上升趨勢(shì)(潘科等, 2014; 宋永剛等, 2016)，以渤海西北岸的錦州灣海域?yàn)槔?，其沉積物中Cu 和Cd 的濃度最高分別可達(dá)1072 和1463 mg/kg，海水中濃度則分別為1.7～3.5 和1.7～2.0 μg/L(Panet al,2012)。2002 年 10 月，江蘇省如東洋口出現(xiàn)文蛤(Meretrix meretrix)大面積死亡現(xiàn)象，死亡文蛤體內(nèi)檢出極高的Cd、Pb 和Zn 含量(詹文毅等, 2003)。中國(guó)北方的典型半封閉式海灣——膠州灣河口沉積物中Cu 和Cd 濃度分別為600 和27 mg/kg，受到重金屬污染的巨大壓力(Denget al, 2010)。由此可見，重金屬污染已威脅到近岸灘涂貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是中國(guó)沿海灘涂常見的經(jīng)濟(jì)貝類，棲息于近岸泥沙底質(zhì)區(qū)域的淺表層，該區(qū)域受人類活動(dòng)的影響極其顯著，其棲息地的 pH 和鹽度等較外海變化大且復(fù)雜(劉鵬飛,2016)。Riba 等(2004)研究顯示，pH 值降低可增加沉積物中重金屬的遷移率，導(dǎo)致已穩(wěn)定在沉積物中的重金屬，如Cu、Cd、Zn 和Pb 的二次釋放。在海洋酸化(ocean acidification, OA)日趨加劇的背景下(李曉梅等, 2016)，研究重金屬在不同pH 條件下對(duì)灘涂貝類的生理脅迫具有重要的生態(tài)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)關(guān)于重金屬與酸化復(fù)合脅迫對(duì)貝類生理影響的研究有較大進(jìn)展，但大多集中于牡蠣和魁蚶(Scapharca broughtonii)等(曹瑞文, 2019; 李陽(yáng),2018; 李曉梅等, 2016)，針對(duì)菲律賓蛤仔的研究較少。本文研究了不同pH 條件下(8.2、7.7 和7.3)，重金屬Cu 和Cd 對(duì)蛤仔生理的影響，除了選取耗氧率(OR)和濾水率(FR) 2 個(gè)重要生理指標(biāo)外，連續(xù)監(jiān)測(cè)了蛤仔心率的變化，以獲取實(shí)時(shí)、直觀和連續(xù)的觀測(cè)結(jié)果，旨在研究海洋酸化背景下重金屬對(duì)灘涂貝類生理的影響，為面臨全球氣候變化與重金屬污染等多重壓力的海水養(yǎng)殖提供參考，同時(shí)探討心率在水生生物實(shí)驗(yàn)中作為生理指標(biāo)的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

以普通海水(pH 8.2)作為對(duì)照組，配制2 種酸化海水(pH 7.7 和7.3)，并選取了重金屬Cu 和Cd 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Cu 和Cd 各設(shè)置3 個(gè)濃度，分別為0、0.06、0.60 mg/L 和0、0.03、0.30 mg/L，濃度設(shè)置參考李陽(yáng)(2018)對(duì)魁蚶的研究。2 種酸化海水設(shè)置分別參照政府間氣候變化專門委員會(huì)(IPCC)對(duì)2100 年和2300 年海水表面pH 的預(yù)測(cè)(Caldeiraet al, 2005)。

菲律賓蛤仔取自膠州灣海域，選取外殼完整、健康且大小一致[(32.07±1.39) mm]的個(gè)體，于60.0 cm×40.0 cm×30.0 cm 的聚乙烯水槽內(nèi)暫養(yǎng)7 d。暫養(yǎng)過(guò)程中，保持連續(xù)充氣，每24 h 換水1 次，每天投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana)(4×104cells/mL) 2 次。實(shí)驗(yàn)前1 d 停止投喂。

實(shí)驗(yàn)在國(guó)家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)中心(山東威海)進(jìn)行，海水取自愛倫灣海域(37°9′N，122°33′E)，鹽度為32.0±1.0，pH 為8.17±0.02，經(jīng)沉淀、砂濾后備用。實(shí)驗(yàn)前2 h，使用CO2氣瓶配制酸化海水，分別調(diào)節(jié)pH 至7.7 和7.3，只充干燥空氣的海水作為對(duì)照組(C)，實(shí)測(cè)pH 及水體初始溶解氧(DO)見表1。酸化組海水DO 與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)，不會(huì)影響蛤仔正常呼吸。用CuSO4和CdCl2(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)分別配制0.5 mg/mL 的Cu 和Cd 溶液作為母液，實(shí)驗(yàn)時(shí)按濃度要求進(jìn)行稀釋。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持(22.0±0.5)℃恒定室溫。

表1 實(shí)驗(yàn)海水pH、重金屬濃度和菲律賓蛤仔規(guī)格Tab.1 Seawater pH, concentration of heavy metals, and biological characteristics of R. philippinarum

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耗氧率測(cè)定 使用四通道光纖測(cè)氧儀(OXY-4 mini，德國(guó))測(cè)定DO，數(shù)據(jù)由電腦軟件Precens記錄。呼吸瓶為250 mL 廣口瓶，瓶蓋預(yù)先鉆小孔連接氧探針及溫度探針，用以連續(xù)監(jiān)測(cè)水體溫度及DO。每個(gè)呼吸瓶放置3 個(gè)蛤仔，每組4 個(gè)重復(fù)，另設(shè)空白對(duì)照，待蛤仔均伸出水管后計(jì)時(shí)，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為0.5～1 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)量蛤仔規(guī)格及軟組織干質(zhì)量。使用Excel 以DO 和實(shí)驗(yàn)時(shí)間t(h)作圖，并線性擬合得到函數(shù)y=kt+a，OR 計(jì)算公式為，

式中，OR 為單位體重耗氧率[mg/(g·h)]，k為擬合直線斜率，W為干質(zhì)量(g)，V為呼吸瓶體積(L)。

1.2.2 濾水率測(cè)定 實(shí)驗(yàn)在500 mL 燒杯中進(jìn)行，海水中放入一定數(shù)量的球等鞭金藻，濃度控制在30×104～50×104cells/mL，保持微充氣使金藻混合均勻。每個(gè)實(shí)驗(yàn)容器放置3 個(gè)蛤仔，每組4 個(gè)重復(fù)，另設(shè)空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為0.5～1 h。使用血球計(jì)數(shù)板鏡檢法分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后海水中球等鞭金藻的濃度，將蛤仔軟體部剖出，60℃烘至恒重，稱重。濾水率參考杜美榮等(2009)的方法計(jì)算。

1.2.3 心率測(cè)定 參考林思恒等(2016)測(cè)定鮑魚心率的非損傷性方法，使用藍(lán)丁膠(Blu-Tack, Bostik Ltd, 英國(guó))將紅外傳感器固定在蛤仔心臟對(duì)應(yīng)的殼表面，心跳產(chǎn)生的光電流經(jīng)信號(hào)放大器(AMP 03,heartbeat monitor, Newshift, 葡萄牙)放大過(guò)濾處理后，由數(shù)據(jù)采集(DAQ)設(shè)備(Powerlab 8/30, AD Instruments, 德國(guó))記錄，利用軟件LabChart V8.0 可計(jì)算出心率(bpm)。根據(jù)耗氧率和濾水率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取影響較明顯但未過(guò)度降低蛤仔活力的0.06 mg/L Cu、0.30 mg/L Cd 和pH 7.3 進(jìn)行心率測(cè)定，以普通海水作為對(duì)照組(C)。隨機(jī)選取菲律賓蛤仔16 個(gè)，連接傳感器并在普通海水中暫養(yǎng)至心率穩(wěn)定(蛤仔活躍且15 min 內(nèi)心率無(wú)明顯波動(dòng)視為心率穩(wěn)定)，之后分別轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)用海水中，每組4 個(gè)蛤仔。記錄蛤仔心率變化，持續(xù)時(shí)間約為0.5 h。

利用軟件SPSS 19.0 分析比較不同海水pH 條件下Cu 和Cd 對(duì)菲律賓蛤仔OR、FR 和心率的影響，以P＜0.05 作為顯著性差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 菲律賓蛤仔在不同脅迫條件下的耗氧率和濾水率

實(shí)驗(yàn)期間對(duì)照組(普通海水)菲律賓蛤仔OR 為(1.86±0.10) mg/(g·h)，F(xiàn)R 為(0.64±0.13) L/(g·h)，差異均不顯著(P＞0.05)(圖 1 和圖 2)。單因素方差分析(one-way ANOVA)顯示，Cu 對(duì)蛤仔的OR 和FR 均有顯著影響(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，菲律賓蛤仔在含有Cu 的海水中活動(dòng)明顯減少，且出現(xiàn)進(jìn)出水管回縮及閉殼現(xiàn)象。在含0.60 mg/L Cu 的海水中(包括酸化及未酸化海水)，蛤仔的OR 和FR 均趨近于0。pH 對(duì)蛤仔OR 和FR 無(wú)顯著影響(P＞0.05)，但在Cu 為0.06 mg/L 時(shí)，隨著pH 的下降，OR 略有上升(P＞0.05)。雙因素方差分析(two-way ANOVA)結(jié)果顯示(表2)，pH 和Cu 脅迫對(duì)蛤仔OR 和FR 無(wú)交互作用(P＞0.05)。

圖1 不同酸化和Cu 處理下菲律賓蛤仔的耗氧率變化Fig.1 Variation of oxygen consumption rate of clams at different acidification and Cu treatments

圖2 不同酸化和Cu 處理下菲律賓蛤仔的濾水率變化Fig.2 Variation of filtration rate of clams at different acidification and Cu treatments

與Cu 不同，蛤仔在含Cd 的海水中無(wú)明顯異常，水管噴水活躍，狀態(tài)與對(duì)照組基本相同。pH 8.2 與pH 7.3 處理組中Cd 對(duì)OR 影響不顯著(P＞0.05)，但隨著Cd 濃度的升高，OR 有下降趨勢(shì)(圖3)。當(dāng)海水pH為7.7 時(shí)，Cd 處理組的蛤仔OR 顯著低于無(wú)Cd 海水中蛤仔的OR(P＜0.05)。Cd 對(duì)菲律賓蛤仔的FR 影響不顯著(P＞0.05)(圖4)。雙因素方差分析結(jié)果顯示，pH和Cd脅迫對(duì)蛤仔OR和FR沒有交互作用(P＞0.05)(表2)。

表2 蛤仔耗氧率和濾水率在酸化和重金屬脅迫條件下的雙因素方差分析Tab.2 Two-way ANOVA of the OR and FR of calm under acidification and heavy metal addition

圖3 不同酸化和Cd 處理下菲律賓蛤仔的耗氧率變化Fig.3 Variation of oxygen consumption rate of clams at different acidification and Cd treatments

圖4 不同酸化和Cd 處理下菲律賓蛤仔的濾水率變化Fig.4 Variation of filtration rate of clams at different acidification and Cd treatments

2.2 菲律賓蛤仔在不同脅迫條件下的心率

在心率測(cè)定中，每組有3～4 個(gè)個(gè)體獲得有效心率測(cè)定結(jié)果，取平均值進(jìn)行對(duì)比(圖5)，并選取5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0、5、6、11 和20 min)，比較各實(shí)驗(yàn)組蛤仔心率的差異(表3)。蛤仔初始心率均值為(24.2±4.7) bpm，差異不顯著(P＞0.05)，隨著時(shí)間的變化，各組心率呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。Cd 處理組(0.30 mg/L Cd，pH 8.2)蛤仔的心率在0～15 min 時(shí)明顯上升，15 min 后心率逐漸穩(wěn)定，20 min 時(shí)蛤仔心率(39.0 bpm)相比初始值(26.0 bpm)上升了50%。Cu 處理組(0.06 mg/L Cu，pH 8.2)蛤仔的心率在0～10 min 時(shí)明顯下降，10 min 后逐漸穩(wěn)定，20 min 時(shí)蛤仔心率[(10.6±0.3) bpm]約為初始值的45%。酸化組中(pH=7.3)，蛤仔的心率呈先下降后緩慢回升的趨勢(shì)，并在 20 min 時(shí)恢復(fù)至(20.5±4.3) bpm，與初始心率無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖5 Cu、Cd 或酸化處理下菲律賓蛤仔的心率變化Fig.5 Variation of heart rate of clams at Cu, Cd or acidification treatments

表3 相同處理時(shí)間各實(shí)驗(yàn)組菲律賓蛤仔的心率Tab.3 Heart rate of clams at the same incubation time among different treatments

3 討論

3.1 菲律賓蛤仔在不同脅迫條件下的耗氧率和濾水率

Cu 是機(jī)體必不可少的金屬元素，在軟體動(dòng)物中參與形成各種金屬酶結(jié)構(gòu)，但當(dāng)機(jī)體過(guò)度攝入Cu 時(shí)則會(huì)產(chǎn)生毒性(Arumugamet al, 2020; Bartlettet al,2020; Panet al, 2009)。Ivanina 等(2015)使用與當(dāng)?shù)丨h(huán)境水平相近的Cu 和Cd 濃度(0.05 mg/L)進(jìn)行了7 d 的暴露實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)美洲牡蠣(Crassostrea virginica)和美洲簾蛤(Mercenaria mercenaria)的組織能夠很好地抵御金屬誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，且對(duì)于Cu 有更好的處理能力。而在本研究中，0.06 mg/L 的Cu 即對(duì)蛤仔生理產(chǎn)生顯著影響。由此可見，重金屬對(duì)海洋雙殼類的影響具有物種特異性，且與暴露時(shí)間有關(guān)。李陽(yáng)等(2018)也證明了這一點(diǎn)，Cu 脅迫顯著降低魁蚶耗氧率、排氨率和氧氮比，且降低程度與暴露時(shí)間和濃度有關(guān)；經(jīng)0.1 mg/L Cu 暴露96 h 后，魁蚶鰓絲出現(xiàn)尖端膨大、排列散亂以及細(xì)胞溶出等現(xiàn)象。Grace 等(1987)研究表明，Cu 可導(dǎo)致鰓中絲間隔斷裂，但不影響與生物體分離后的鰓纖毛的擺動(dòng)，其對(duì)側(cè)纖毛的抑制是一種神經(jīng)元機(jī)制。因此，Cu 降低濾水率可能是神經(jīng)抑制以及鰓絲分離共同作用的結(jié)果。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于Cd 對(duì)雙殼貝類的急性毒性及生物蓄積相關(guān)研究較多，但缺乏詳細(xì)的生理代謝數(shù)據(jù)(Rattikansukhaet al, 2019; 陳海剛等, 2008)。本研究中，Cd 脅迫對(duì)菲律賓蛤仔的耗氧率和濾水率的影響小于Cu 脅迫，這可能是由于低濃度Cd 暴露引起了蛤仔體內(nèi)防御機(jī)制的啟動(dòng)，誘導(dǎo)了金屬螯合劑，如金屬硫蛋白(MTs)和鐵蛋白的表達(dá)上調(diào)(徐彥等, 2013)，在一定程度上消除了Cd 的毒性，因此，耗氧率和濾水率沒有顯著變化。Blasco 等(1999)的研究也表明，Cd 對(duì)雙殼類天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的毒性小于Cu。Shi 等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期海水酸化與Cd(0.05 mg/L)復(fù)合脅迫實(shí)驗(yàn)中，低pH 環(huán)境(7.8 和7.4)會(huì)促進(jìn)Cd 在雙殼類鰓、外套膜和閉殼肌中的積累，這可能是本研究中酸化與Cd 復(fù)合脅迫下蛤仔耗氧率下降的原因，而由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，不同pH 導(dǎo)致的下降程度并不一致。

高山等(2017)研究發(fā)現(xiàn)，青蛤(Cyclina sinensis)在酸化環(huán)境下培養(yǎng)10 d 后耗氧率顯著降低，死亡率與酸化時(shí)間正相關(guān)，而本研究?jī)H針對(duì)短期酸化進(jìn)行了分析，這可能是pH 對(duì)蛤仔耗氧率和濾水率無(wú)顯著影響的原因，同時(shí)，導(dǎo)致pH 與Cu/Cd 沒有顯著交互作用。另外，沿海灘涂環(huán)境由于陸地徑流和潮汐的影響，pH 波動(dòng)較大，菲律賓蛤仔作為典型的潮間帶生物，可能已建立了短期酸化處理下的應(yīng)激適應(yīng)機(jī)制，這也是短期酸化對(duì)蛤仔影響較小的原因之一。

3.2 菲律賓蛤仔在不同脅迫條件下的心率

雙殼類的心臟是肌源性的，心臟神經(jīng)或內(nèi)臟神經(jīng)節(jié)的刺激可能影響心臟搏動(dòng)，Cu 或Cd 可以象影響側(cè)纖毛一樣通過(guò)神經(jīng)通路影響心率(Graceet al, 1987)。需要注意的是，實(shí)驗(yàn)中各項(xiàng)生理指標(biāo)的降低總是伴隨著蛤仔的閉殼行為。Davenport 等(1984)研究指出，心跳過(guò)緩是心臟瓣膜關(guān)閉導(dǎo)致的，貽貝可以探測(cè)到環(huán)境中的Cu 并相應(yīng)地關(guān)閉貝殼，或不改變貝殼開放程度而改變泵送速率，這可能是Cu 導(dǎo)致蛤仔心率下降的原因之一。Ivanina 等(2015)研究指出，暴露于0.05 mg/L Cd 可導(dǎo)致雙殼類血細(xì)胞胞內(nèi)H+(pHi)濃度下降30%～50%，而0.05 mg/L Cu 對(duì)pHi無(wú)影響。Anwer等(1993)對(duì)哺乳動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn)，Cd 可以通過(guò)刺激Na+/H+交換器和干擾胞內(nèi)Ca2+信號(hào)(模擬Ca2+流入細(xì)胞)干擾細(xì)胞代謝、信號(hào)傳導(dǎo)和離子運(yùn)輸。本研究中，0.30 mg/L Cd 可能通過(guò)干擾蛤仔體內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，刺激了心臟神經(jīng)，并最終導(dǎo)致蛤仔心跳過(guò)速。

海水pH 驟降到7.3，蛤仔心率先下降后迅速恢復(fù)正常的原因如前所述，可能與蛤仔對(duì)短期酸化的應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)。Ivanina 等(2015)研究也表明，海水pCO2及pH 的改變對(duì)雙殼類血細(xì)胞的pHi和酸堿穩(wěn)態(tài)無(wú)顯著影響，這也是酸化海水下蛤仔心率較為穩(wěn)定的原因。通過(guò)紅外線信號(hào)方法測(cè)定心率具有非損傷性、可進(jìn)行原位測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)，且得到的指標(biāo)可以精準(zhǔn)量化(林思恒等, 2016)，已在皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)和貽貝(Brabyet al, 2006)等無(wú)脊椎動(dòng)物中得到應(yīng)用。本研究中，相比耗氧率和濾水率等常規(guī)指標(biāo)，心率監(jiān)測(cè)反映了蛤仔受到脅迫后的即時(shí)反應(yīng)，在較短的時(shí)間內(nèi)即可顯示出差別，適合作為短期實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)。由于其無(wú)損傷性的特點(diǎn)，也可用于珍稀貝類的實(shí)驗(yàn)。但同時(shí)，心率測(cè)定也存在其劣勢(shì)。實(shí)驗(yàn)選用的蛤仔個(gè)體較小，且外殼有一定弧度，紅外探頭需通過(guò)藍(lán)丁膠緊密貼合在心臟處的殼表面，實(shí)際操作過(guò)程中有可能出現(xiàn)蛤仔心率曲線缺失現(xiàn)象，未來(lái)需進(jìn)一步優(yōu)化探頭連接。

本研究?jī)H涉及了pH 與重金屬的短期脅迫，未來(lái)可進(jìn)一步探討長(zhǎng)期酸化條件下pH 與重金屬的復(fù)合效應(yīng)。目前，尚未找到pH 影響重金屬對(duì)雙殼類毒性的有力證據(jù)，但pH 變化對(duì)污染河口的金屬動(dòng)力學(xué)和遷移影響已有較多研究證實(shí)(Hylandet al, 1999; Mountet al, 1992; Schubauer-Beriganet al, 1993)。目前，養(yǎng)殖業(yè)面臨的壓力更多來(lái)自河口及沿海地區(qū)的重金屬污染，未來(lái)應(yīng)對(duì)養(yǎng)殖用水以及底質(zhì)環(huán)境嚴(yán)格規(guī)范以保障食品安全。

致謝：感謝中國(guó)科學(xué)院海洋研究所實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為心率測(cè)定提供儀器協(xié)助，感謝林思恒在儀器使用和心率測(cè)定過(guò)程中提供的指導(dǎo)和建議。感謝中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)林琳在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中給予的幫助與支持。