牟 銘 李 昂 趙新寧 柳淑芳① 莊志猛

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306；2. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071)

環(huán)境 DNA 宏條形碼技術(shù)(environmental DNA metabarcoding)可以通過(guò)高通量測(cè)序?qū)Νh(huán)境 DNA(eDNA)進(jìn)行多物種分類鑒定。隨著eDNA 宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，該技術(shù)對(duì)群落中單一或組合物種的定量評(píng)估逐漸顯現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)。無(wú)論是水族箱或中觀實(shí)驗(yàn)等小型生態(tài)系統(tǒng)(Minamotoet al; Moyeret al, 2014;Pilliodet al, 2013; Thomsenet al, 2012; Doiet al,2017)，還是江河湖泊等自然淡水系統(tǒng)(Doiet al, 2017;Lacoursiererousselet al, 2016)，甚至是開放式的海洋系統(tǒng)(Joet al, 2017)，研究人員都嘗試過(guò)使用eDNA宏條形碼技術(shù)測(cè)算種群相對(duì)數(shù)量。大量研究表明，特定環(huán)境中物種的個(gè)體數(shù)量和基于eDNA 宏條形碼技術(shù)獲得的高通量測(cè)序reads 數(shù)之間具有明顯的相關(guān)性。Evans 等(2016)設(shè)計(jì)了一個(gè)包含魚類和兩棲類的中觀實(shí)驗(yàn)，證明水體中物種個(gè)體數(shù)或生物量相對(duì)豐度與eDNA 宏條形碼技術(shù)獲得的高通量測(cè)序reads 數(shù)呈正相關(guān)；Hanfling 等(2016)對(duì)比較了一個(gè)天然湖泊的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)魚類豐度結(jié)果與eDNA 宏條形碼技術(shù)得到的高通量測(cè)序reads 數(shù)之間的相關(guān)性，結(jié)果表明二者呈正相關(guān)；Thomsen 等(2016)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將魚類的eDNA 高通量測(cè)序reads 數(shù)聚類到“科”的分類等級(jí)時(shí)，eDNA 宏條形碼技術(shù)測(cè)得的深海生境中的生物量與傳統(tǒng)拖網(wǎng)捕撈數(shù)據(jù)比較吻合?？梢灶A(yù)見(jiàn)，eDNA 宏條形碼技術(shù)具有快速測(cè)算群落中物種豐度的潛能，將成為資源保護(hù)和管理中具有應(yīng)用前景的調(diào)查工具。

然而，通過(guò)對(duì)已發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行梳理和歸納，發(fā)現(xiàn)當(dāng)前大多數(shù)利用eDNA 高通量測(cè)序結(jié)果的reads 數(shù)來(lái)評(píng)估自然環(huán)境中生物相對(duì)數(shù)量的研究并不能得到明確的量化關(guān)系結(jié)果(Limet al, 2016)。究其原因，是因?yàn)閺纳锏絜DNA 以及從eDNA 再到高通量測(cè)序結(jié)果的2 個(gè)過(guò)程中的數(shù)學(xué)關(guān)系難以理清。其中，實(shí)驗(yàn)室操作過(guò)程中的主要問(wèn)題是：(1)自然水體中，不同濃度 eDNA 富集效率不同(Kellyet al, 2016)；(2)PCR 擴(kuò)增過(guò)程中，通用引物對(duì)不同物種DNA 存在偏倚性(Elbrechtet al, 2015; Pinolet al, 2015)。假定水體中的eDNA 全部回收，且PCR 擴(kuò)增時(shí)不存在引物偏倚性，這種理想狀態(tài)下的水體中eDNA 組成與其高通量測(cè)序reads 數(shù)是否完全呈線性關(guān)系？為了探究這個(gè)問(wèn)題，本研究在實(shí)驗(yàn)室可控條件下，選擇2 個(gè)同屬近緣種，對(duì)其DNA 樣品進(jìn)行不同比例混合，模擬從自然水體中富集到的eDNA 復(fù)合樣品，既保證了樣品的回收率，又降低了引物偏倚的干擾。以此為模板，探究eDNA 宏條形碼技術(shù)檢測(cè)種群相對(duì)數(shù)量的準(zhǔn)確性，旨在為驗(yàn)證eDNA 宏條形碼技術(shù)監(jiān)測(cè)水生生物資源量的可行性提供直接證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)

1.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品的選擇 鑒于通用引物對(duì)不同物種的擴(kuò)增效率有所不同，本研究實(shí)驗(yàn)樣品選取2 個(gè)同屬近緣物種用于制備模擬eDNA 樣品，以確保將PCR過(guò)程中因引物對(duì)物種DNA 的偏移引起的實(shí)驗(yàn)誤差降低到最小程度。

實(shí)驗(yàn)樣品選擇了2 種常見(jiàn)對(duì)蝦：凡納濱對(duì)蝦(Penaeus vannamei)和墨吉對(duì)蝦(Penaeus merguiensis)，它們同為節(jié)肢動(dòng)物門(Arthropoda)、軟甲綱(Malacostraca)、十足目(Decapoda)、對(duì)蝦科(Penaeidae)、對(duì)蝦屬(Penaeus)，是較為常見(jiàn)的同屬近緣種。

1.1.2 模板DNA 的提取 采用傳統(tǒng)的酚-氯仿-異戊醇方法分別提取2 種對(duì)蝦肌肉組織DNA，經(jīng)純化后使用超微量核酸蛋白分析儀(GE，美國(guó))檢測(cè)濃度，稀釋DNA 濃度至20 ng/μL (±1%)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 模擬eDNA 的制備 人工模擬eDNA 復(fù)合樣品，共設(shè)7 個(gè)實(shí)驗(yàn)組：將凡納濱對(duì)蝦和墨吉對(duì)蝦的DNA 模板分別按照1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶10、1∶50 和1∶100 的比例均勻混合，且混合后DNA 終濃度一致。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照2 組：分別選用凡納濱對(duì)蝦和墨吉對(duì)蝦DNA 樣品。設(shè)陰性對(duì)照1 組：用純水代替DNA 樣品。每組樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

將上述制備的eDNA 復(fù)合樣品作為eDNA 宏條形碼檢測(cè)的模板DNA。

1.2 通用引物的選取

考慮到后續(xù)高通量測(cè)序及DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)信息資源的豐富度，本研究選取了Leray 等(2013)推薦的長(zhǎng)度為313 bp 的線粒體COⅠ基因序列作為待測(cè)eDNA 目標(biāo)片段，該片段長(zhǎng)度適中、數(shù)據(jù)資源豐富、物種鑒定特異性好，且引物通用性強(qiáng)。通用引物序列見(jiàn)表1，由華大基因有限公司合成。

表1 COⅠ基因PCR 擴(kuò)增引物信息Tab.1 Primer sets of COⅠ used for PCR amplification

1.3 PCR 擴(kuò)增

PCR 擴(kuò) 增 體 系：2×RapidTaqMaster Mix(Vazyme) 25 μL，上下游引物(mlCOⅠintF/jgHCO2198)(10mmol/L)各2 μL，DNA 模板5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊總體積至50 μL。

為了增強(qiáng)擴(kuò)增特異性，使用Touch down PCR 反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，16 個(gè)循環(huán)；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，25 個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min；4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物質(zhì)量，選用DL2000 DNA marker，目標(biāo)條帶約為300 bp。挑選電泳條帶單一且明亮的PCR 產(chǎn)物用于高通量測(cè)序。

1.4 測(cè)序及結(jié)果注釋

將所得PCR 產(chǎn)物送至青島歐易生物科技有限公司，進(jìn)行高通量測(cè)序。采用Illumina Miseq 平臺(tái)測(cè)序。

按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)聚類，在聚類過(guò)程中去除嵌合體(chimera，融合了2 個(gè)不同序列信息的序列)、異源雙鏈序列等干擾序列，得到OTU 聚類結(jié)果，然后對(duì)不同OTU 的代表序列進(jìn)行結(jié)果注釋。在結(jié)果注釋時(shí)，參照 NCBI 公共數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)來(lái)進(jìn)行分類學(xué)信息的標(biāo)注，同時(shí)使用中國(guó)重要漁業(yè)生物DNA 條形碼信息平臺(tái)(http://www.fisherybarcode.cn)對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行輔助校正。

1.5 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品高通量測(cè)序的原始reads 數(shù)，以所有樣本中reads 數(shù)最低值為基準(zhǔn)，進(jìn)行抽平，使每個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果的reads 數(shù)相同，用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

在推導(dǎo)數(shù)學(xué)關(guān)系時(shí)，設(shè)：eDNA 樣品來(lái)自2 個(gè)物種，分別為A、B；實(shí)際參與PCR 反應(yīng)的底物模板DNA 的量為n；參與PCR 反應(yīng)的底物模板DNA 理論量為x；每個(gè)循環(huán)中，參與擴(kuò)增的2 個(gè)物種底物模板DNA 比率為λ；擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)為c；PCR 產(chǎn)物的高通量測(cè)序reads 數(shù)為y。假定理想情況為：在PCR 擴(kuò)增的不同循環(huán)中，參與擴(kuò)增的2 個(gè)物種底物模板DNA比率固定；PCR 擴(kuò)增全程都保持底數(shù)為2 的指數(shù)增長(zhǎng)型(反應(yīng)物足夠)，則高通量測(cè)序reads 數(shù)可以反應(yīng)eDNA 樣品中2 個(gè)物種的相對(duì)量，即推得公式(1)：

經(jīng)變形得公式(2)：

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

以人工模擬的7 組eDNA 復(fù)合樣品及對(duì)照組樣品為模板，使用eDNA 宏條形碼通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照和7 個(gè)實(shí)驗(yàn)組均成功擴(kuò)增出300 bp 左右的目標(biāo)片段，陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of agarose gel electrophoresis

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)

2.2.1 高通量測(cè)序結(jié)果 本研究對(duì)7 個(gè)實(shí)驗(yàn)組共21 個(gè)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行了高通量測(cè)序。統(tǒng)計(jì)高通量測(cè)序獲得的序列長(zhǎng)度分布，顯示99.80%以上序列的長(zhǎng)度分布于301～350 bp 之間(圖2)。抽平后共計(jì)獲得有效序列674,205 條，序列平均長(zhǎng)度為312.41 bp。

圖2 測(cè)序數(shù)據(jù)長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)Fig.2 Result of distributional interval of the sequence length

2.2.2 分類學(xué)信息注釋及reads 數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 將每個(gè)樣品reads 總數(shù)抽平后，對(duì)674,205 條序列進(jìn)行分類學(xué)信息注釋，保留有效序列(序列長(zhǎng)度在301～350之間，且分類學(xué)信息注釋結(jié)果是墨吉對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦)的reads。各實(shí)驗(yàn)組高通量測(cè)序reads 數(shù)及其分類注釋結(jié)果詳見(jiàn)表2。實(shí)驗(yàn)組I 的3 組平行樣共獲得94,774 條序列，每個(gè)樣品注釋出的墨吉對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦平均reads 數(shù)分別為11,097 和20,494，二者的比值為13/24；實(shí)驗(yàn)組Ⅱ的3 組平行樣共獲得95,208 條序列，二者reads 數(shù)比值為18/23；實(shí)驗(yàn)組Ⅲ的3 組平行樣共獲得 95,572 條序列，二者 reads 數(shù)比值為77/73；實(shí)驗(yàn)組Ⅳ的3 組平行樣共獲得95,250 條序列，二者reads 數(shù)比值為67/44；實(shí)驗(yàn)組Ⅴ的3 組平行樣共獲得94,408 條序列，二者reads 數(shù)比值為43/24；實(shí)驗(yàn)組Ⅵ的3 組平行樣共獲得94,640 條序列，二者reads數(shù)比值為 127/35；實(shí)驗(yàn)組Ⅶ的 3 組平行樣共獲得95,526 條序列，二者reads 數(shù)比值為187/23。

表2 各實(shí)驗(yàn)組獲得的序列數(shù)及分類學(xué)信息注釋Tab.2 Results of taxonomic information and numbers of reads

2.2.3 混合模板PCR 擴(kuò)增的引物偏倚率 當(dāng)模板中2 個(gè)物種DNA 濃度比例為1∶1 (墨吉對(duì)蝦/凡納濱對(duì)蝦)時(shí)，2 個(gè)物種的模板DNA 含量相同，擴(kuò)增過(guò)程中主要是引物對(duì)不同底物的偏好引起的擴(kuò)增產(chǎn)物差別，此時(shí)主要是引物偏倚引起的reads 數(shù)差距。根據(jù)公式(2)變形得：

代入擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，由reads 平均數(shù)比值，計(jì)算得到每個(gè)循環(huán)中參與反應(yīng)的2 個(gè)物種模板DNA 的平均比率為66/67，換言之，PCR 擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中，平均偏倚率為1/67，約為1.5%，即該引物在同一PCR體系中，每次退火過(guò)程對(duì)墨吉對(duì)蝦DNA 模板的結(jié)合率比凡納濱對(duì)蝦DNA 模板大約少1.5%。

2.2.4 eDNA 組成與高通量測(cè)序reads 數(shù)的函數(shù)關(guān)系

以各實(shí)驗(yàn)組設(shè)置的底物中墨吉對(duì)蝦DNA 與凡納濱對(duì)蝦DNA 的比值為橫坐標(biāo)，以各實(shí)驗(yàn)組樣品高通量測(cè)序結(jié)果注釋的墨吉對(duì)蝦與凡納濱對(duì)蝦reads 平均數(shù)的比值為縱坐標(biāo)，繪制eDNA 組成與高通量測(cè)序reads 數(shù)的函數(shù)關(guān)系圖。在公式(2)的前提假設(shè)條件下，在高通量結(jié)果中，2 種對(duì)蝦的reads 數(shù)之比和初始PCR模板DNA 中2 種對(duì)蝦的DNA 比例應(yīng)呈現(xiàn)y=kx線性關(guān)系，對(duì)表2 中的7 個(gè)實(shí)驗(yàn)組的reads 平均數(shù)比值和PCR 模板DNA 比值的2 組數(shù)據(jù)進(jìn)行一元線性回歸分析，最終得出eDNA 組成與高通量測(cè)序reads 數(shù)的函數(shù)關(guān)系：y=0.0716x+0.7043 (r2=0.9824)(圖3)。

圖3 2 個(gè)物種高通量測(cè)序結(jié)果的序列數(shù)比值與模板比例的關(guān)系Fig.3 The curve of ratio of two species'reads and ratio of template DNA

3 討論

利用eDNA 宏條形碼技術(shù)來(lái)評(píng)估水體中不同物種的相對(duì)數(shù)量，是該技術(shù)最具潛力的應(yīng)用前景之一。與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，eDNA 宏條形碼技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)高效且對(duì)自然資源破壞小等特點(diǎn)。如何使用該技術(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)水體中的生物量，一直是學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)，但水體中的eDNA 難以完全富集，且富集到的eDNA 成分復(fù)雜；PCR 擴(kuò)增時(shí)，引物對(duì)不同種類DNA模板的偏好還會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增效率不同，這些問(wèn)題亦是eDNA 宏條形碼技術(shù)推廣應(yīng)用的最大障礙。為運(yùn)用eDNA 宏條形碼技術(shù)檢測(cè)環(huán)境生物相對(duì)數(shù)量而設(shè)計(jì)的中觀實(shí)驗(yàn)，大都是在嘗試推導(dǎo)生物量與高通量測(cè)序結(jié)果reads 數(shù)的數(shù)學(xué)關(guān)系，主要包括環(huán)境中生物量與eDNA 量、環(huán)境中eDNA 量與提取的eDNA 量和提取的eDNA 模板與PCR 產(chǎn)物的高通量測(cè)序結(jié)果等3 個(gè)對(duì)應(yīng)關(guān)系，其中任何一個(gè)關(guān)系不明確，都將影響eDNA 宏條形碼技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果，所以，必須逐步理清這3 種對(duì)應(yīng)關(guān)系的函數(shù)關(guān)系，進(jìn)而得到“高魯棒性”(模式體系固定且成熟，效果準(zhǔn)確且穩(wěn)定)的eDNA宏條形碼方法應(yīng)用體系。

分解困難是解決問(wèn)題的有效方法之一，剖析DNA宏條形碼技術(shù)全過(guò)程，當(dāng)只關(guān)注富集到的eDNA 擴(kuò)增及測(cè)序時(shí)，如果能創(chuàng)造一種eDNA 成分簡(jiǎn)單、無(wú)引物偏好影響的理想條件，進(jìn)而探索eDNA 高通量測(cè)序reads 數(shù)和底物eDNA 含量之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，便可以收獲“柳暗花明”的結(jié)果。

3.1 混合模板PCR 擴(kuò)增的引物偏倚性

影響多物種eDNA 混合模板PCR 擴(kuò)增效率的主要原因之一，便是PCR 過(guò)程中引物對(duì)不同模板DNA堿基組成存在偏好性(Kanagawa, 2003)。理論上，引物的每個(gè)脫氧核苷酸和模板DNA 鏈上同源區(qū)段的每個(gè)脫氧核苷酸可以實(shí)現(xiàn)一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，但實(shí)踐過(guò)程中通常難以實(shí)現(xiàn)，任何一個(gè)錯(cuò)配位點(diǎn)的出現(xiàn)都會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的擴(kuò)增效率降低，從而減少產(chǎn)物。為此，通用引物中加入了簡(jiǎn)并堿基以降低錯(cuò)配的影響。然而，在進(jìn)行復(fù)雜模板的PCR 擴(kuò)增時(shí)，即使使用含簡(jiǎn)并堿基的通用引物，引物結(jié)合能力也會(huì)因?yàn)椴煌０錎NA 引物結(jié)合區(qū)段序列的GC 堿基含量高低而不同(Acinaset al, 2005)，GC 含量高的引物結(jié)合力較強(qiáng)(Fonseca,2018)。為了提高模板DNA 引物結(jié)合區(qū)段堿基組成的一致性，從而降低引物偏倚的影響，本研究選擇較為常見(jiàn)的同屬近緣種凡納濱對(duì)蝦和墨吉對(duì)蝦作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。同時(shí)，基于基因的進(jìn)化速率及其數(shù)據(jù)庫(kù)信息的豐富程度等因素，決定以mtDNA 中的COⅠ基因片段作為檢測(cè)的目的基因。

通過(guò)控制上述引物偏好的條件，最終高通量測(cè)序結(jié)果中引物的偏倚程度如何。研究分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)eDNA 模板中凡納濱對(duì)蝦和墨吉對(duì)蝦DNA 組成比例為1∶1 時(shí)，高通量測(cè)序獲得對(duì)應(yīng)物種reads 數(shù)比例為13/24。根據(jù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)和公式(2)，推導(dǎo)此時(shí)參與擴(kuò)增的2 種DNA 比約為66/67，即PCR 擴(kuò)增的平均偏倚率為1/67，約1.5%?？梢?jiàn)選擇凡納濱對(duì)蝦和墨吉對(duì)蝦制備簡(jiǎn)單eDNA 混合模板產(chǎn)生的引物偏倚程度影響較小，符合最初的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期。此時(shí)，2 個(gè)物種的模板濃度相同，高通量測(cè)序結(jié)果的偏倚主要是由于引物對(duì)不同模板的“偏好”程度不同產(chǎn)生的。在后續(xù)eDNA 宏條形碼技術(shù)的數(shù)量性研究探索中，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)可選用近源種作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，從而降低擴(kuò)增過(guò)程中引物對(duì)不同模板偏好性不同而導(dǎo)致的“偏倚”現(xiàn)象。

3.2 eDNA 組成與高通量測(cè)序reads 數(shù)的相關(guān)性

當(dāng)面對(duì)實(shí)際環(huán)境樣本時(shí)，如果直接應(yīng)用eDNA 宏條形碼技術(shù)分析高通量測(cè)序reads 數(shù)與待測(cè)樣本生物量的關(guān)系，從生物到eDNA 以及從eDNA 再到高通量測(cè)序結(jié)果的兩個(gè)過(guò)程中的數(shù)學(xué)關(guān)系則難以理清。鑒于此，本研究采取“化繁為簡(jiǎn)”的策略，主要關(guān)注eDNA與高通量測(cè)序reads 數(shù)之間的關(guān)系。同時(shí)，考慮到復(fù)合底物的PCR 過(guò)程比較復(fù)雜(Harperet al, 2019)，最終注釋到每個(gè)物種的測(cè)序reads 數(shù)都受其反應(yīng)體系的影響，故直接比較樣本間的reads 數(shù)會(huì)產(chǎn)生一定偏差。充分考慮這些影響因素，本研究采用了樣本內(nèi)的2 個(gè)物種reads 數(shù)比值，用于確定其與模板e(cuò)DNA 濃度的相關(guān)性。

統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)組的reads 平均數(shù)比值與PCR 模板e(cuò)DNA 比值2 組數(shù)據(jù)，進(jìn)行一元線性回歸分析，最終得出eDNA 組成與高通量測(cè)序reads 數(shù)的函數(shù)關(guān)系：y= 0.0716x+ 0.7043 (r2=0.9824)。等式中的斜率可反應(yīng)出PCR 擴(kuò)增過(guò)程中的偏倚程度(主要是引物偏倚)，當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)相同，斜率越小，擴(kuò)增過(guò)程中偏倚程度越大。等式中的截距主要是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的誤差或者污染導(dǎo)致的。該等式可描述為：當(dāng)環(huán)境水樣中只存在墨吉對(duì)蝦和凡納濱對(duì)蝦的DNA 時(shí)，可通過(guò)高通量測(cè)序的reads 數(shù)推算出2 個(gè)物種的相對(duì)生物量。

在實(shí)際操作中，可能由于模板e(cuò)DNA 的回收率存在差異，使之不能完全符合預(yù)設(shè)的比例；另外，PCR擴(kuò)增時(shí)并不是全程以底數(shù)為2 的指數(shù)式增長(zhǎng)，且存在其他不可避免的系統(tǒng)誤差，這些因素都會(huì)導(dǎo)致上述線性關(guān)系式出現(xiàn)一定偏離。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果已充分表明，高通量測(cè)序reads 數(shù)與初始模板e(cuò)DNA 含量呈線性正相關(guān)。