孫 雪 李勝杰 杜金星 姜 鵬 周家輝 白俊杰

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室廣東 廣州 510380；2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306)

多基因聚合育種是通過不同基因型的個(gè)體雜交將有利基因聚合到同一個(gè)基因組中，從而獲得優(yōu)良品種的育種方法(Servinet al, 2004)。多基因聚合育種技術(shù)在農(nóng)作物和畜禽中已廣泛被應(yīng)用。利用分子標(biāo)記輔助選擇與傳統(tǒng)選育相結(jié)合的方法，將小麥的高蛋白基因GPC-B1和抗白粉病基因Pm21、1Dx5和1Dy10等進(jìn)行聚合，獲得兼具高蛋白質(zhì)含量和高抗病力性狀的小麥品系(胡云等, 2016)。在優(yōu)質(zhì)肉雞多基因聚合研究中，將4 個(gè)與繁殖性能相關(guān)的基因(NPY、NCOA-1、IGF-1和GDF-9)進(jìn)行聚合，獲得在開產(chǎn)日齡、開產(chǎn)體重及300 日齡合格種蛋率最優(yōu)的優(yōu)勢基因聚合個(gè)體，其繁殖性狀顯著優(yōu)于上一世代親本(王錢保等,2018)。中國美利奴羊(Ovis arios)(曾獻(xiàn)存等, 2011)和蘇姜豬(Sus scrofa)(王宵燕等, 2007)多基因聚合研究結(jié)果顯示，與生長性狀關(guān)聯(lián)的優(yōu)勢基因型聚合數(shù)量越多，生長性狀表型越優(yōu)秀。目前，在水產(chǎn)動(dòng)物中有關(guān)基因聚合研究的報(bào)道較少，孫效文等(2009)對(duì)德國鏡鯉(Cyprinus carpio)群體中最大個(gè)體及最小個(gè)體所富集的優(yōu)勢基因型情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)最大個(gè)體中優(yōu)勢基因型數(shù)量為1.7 個(gè)，最小個(gè)體中優(yōu)勢基因型數(shù)量為0.7 個(gè)，反映了與生長性狀相關(guān)優(yōu)勢基因型的聚合數(shù)量多少與鏡鯉生長速度緊密相關(guān)。李勝杰等(2019)分析了大口黑鱸(Micropterus salmoides)家系中生長性狀相關(guān)優(yōu)勢基因聚合效果，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢基因聚合數(shù)量多少與生長性狀顯著呈正相關(guān)。

草魚(Ctenopharyngodon idella)是我國淡水養(yǎng)殖魚類中年產(chǎn)量最高的養(yǎng)殖品種。目前，在草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中尚未有經(jīng)過人工選育、通過國家審定的優(yōu)良養(yǎng)殖品種。近年來，多數(shù)草魚繁殖場對(duì)繁殖使用親本的操作不規(guī)范，通常選擇親緣關(guān)系近、體型小、性成熟早的個(gè)體進(jìn)行苗種生產(chǎn)，導(dǎo)致養(yǎng)殖草魚出現(xiàn)一定程度的種質(zhì)退化現(xiàn)象，制約草魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展(Jiang,2009; Yuet al, 2014; 田園園等, 2019)。由于草魚的性成熟年齡普遍為4～5 齡，選育周期長，在草魚良種選育研究中，有必要探索利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)來加快草魚良種選育進(jìn)度。本實(shí)驗(yàn)室前期利用候選基因關(guān)聯(lián)分析方法在草魚載脂蛋白A-I-1 基因(apoA-I-1)(劉小獻(xiàn)等, 2012)、丙酮酸激酶1 型(PKL)(唐小紅,2015)、羧肽酶A1 (CPA1)(曹婷婷等, 2012b)、檸檬酸合酶(CS)(樊佳佳等, 2014)、醛縮酶B (Aldo-B)(曹婷婷等, 2012a)、生長催乳素α (SLα)和肌球蛋白重鏈(MYH)基因上篩選到10 個(gè)與生長性狀關(guān)聯(lián)SNP 標(biāo)記，本研究在此基礎(chǔ)上通過對(duì)親本的基因型進(jìn)行分析并構(gòu)建優(yōu)勢基因型聚合家系，進(jìn)一步分析生長相關(guān)優(yōu)勢基因型的聚合數(shù)量與生長性狀的相關(guān)性，以期為草魚分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)資料和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 草魚親本的挑選與養(yǎng)殖

實(shí)驗(yàn)魚來自江蘇省蘇州市未來水產(chǎn)養(yǎng)殖場，從中挑選48 尾親魚，其中，雌魚和雄魚各24 尾，放于同一池塘養(yǎng)殖。將每尾親魚注射電子芯片標(biāo)記，同時(shí)，剪取腹鰭樣本并放入無水乙醇中保存，用于提取DNA 和基因型分析。

1.2 生長性狀相關(guān)分子標(biāo)記的選擇

本實(shí)驗(yàn)室前期所獲得的10 個(gè)與生長性狀相關(guān)的SNP 標(biāo)記(G851A、T+744C、A+762G、C+36A、C-499G、A117C、C+1042A、U8014、U2903 和U11628)分別位于apoA-I-1、PKL、CPA1、CS、Aldo-B、SLα、MYH基因上，經(jīng)關(guān)聯(lián)分析表明，其與生長性狀顯著(P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)相關(guān)。各個(gè)標(biāo)記在進(jìn)行PCR 反應(yīng)中所用的引物序列見表1。所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 所用草魚生長性狀相關(guān)分子標(biāo)記的相關(guān)信息Tab.1 Primers of growth-associated markers of grass crap

1.3 基因組DNA 的提取

使用TIANGEN 海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取草魚親本和子代群體鰭條樣品的基因組DNA，使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀檢測DNA 質(zhì)量和濃度，DNA 保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 生長相關(guān)標(biāo)記的基因型檢測

SNP 標(biāo)記采用SNaPshot 分型方法，分析其在每尾草魚中的基因型，委托上海捷瑞生物工程有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程：首先根據(jù)SNP 標(biāo)記上下游的序列設(shè)計(jì)引物，長度為200～500 bp，用于含有SNP 目的片段的擴(kuò)增，采用多重PCR 方法對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序采用Touch-down 方法，95℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸30 s，11 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的退火溫度降0.5℃；然后，進(jìn)入下一個(gè)循環(huán)程序，94℃變性15 s，54℃退火15 s，72℃延伸30 s，24 個(gè)循環(huán)；最后，72℃延伸3 min。將擴(kuò)增到的目的片段用ExoⅠ和FastAP 進(jìn)行純化，去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物和dNTP。使用SNaPshot 試劑盒(ABI 公司, 美國)中的SNaPshot Mix 試劑與純化后的PCR 產(chǎn)物混合，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)，延伸引物的設(shè)計(jì)是在SNP 標(biāo)記的上游或是反向的下游位置，延伸產(chǎn)物溫度變性后在ABI3730 全自動(dòng)測序儀上進(jìn)行測序。

1.5 家系的構(gòu)建及子代培育

分析各個(gè)與生長性狀相關(guān)的標(biāo)記在24 尾雌魚和24 尾雄魚親本中的基因型分布情況，依據(jù)家系兩親本中至少有一個(gè)雜合子且子代中存在優(yōu)勢基因型的原則，選擇可聚合出優(yōu)勢基因型最多的1 對(duì)親本進(jìn)行繁殖并構(gòu)建全同胞家系。在繁殖過程中，采用人工注射催產(chǎn)劑的方法促進(jìn)產(chǎn)卵，收取的受精卵置于環(huán)道孵化池內(nèi)孵化。將孵出的家系魚苗放入面積為3333 m2的池塘養(yǎng)殖。7 月齡時(shí)，從家系子代中采集382 尾實(shí)驗(yàn)魚進(jìn)行體質(zhì)量、全長、體高、頭長、尾柄高和尾柄長的測量，同時(shí)，剪取腹鰭樣本并放入無水乙醇中保存，用于提取DNA 和基因型分析。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

先對(duì)家系子代個(gè)體中的10 個(gè)生長標(biāo)記進(jìn)行基因分型，再進(jìn)行優(yōu)勢基因型的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)所含優(yōu)勢基因型數(shù)量不同進(jìn)行分組，采用SPSS 19.0 軟件的一般線性模型(general linear model, GLM)，對(duì)不同優(yōu)勢基因數(shù)量的組別與生長性狀之間相關(guān)性進(jìn)行最小二乘分析。統(tǒng)計(jì)分析模型采用如下公式：

式中，Yij為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體觀測值；u為實(shí)驗(yàn)觀測所有個(gè)體的平均值(總體平均值)；Bi為第i個(gè)標(biāo)記的效應(yīng)值；eij為對(duì)應(yīng)于觀察值的隨機(jī)殘差效應(yīng)(徐磊等, 2014)。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚親本基因型分析

分析48 尾草魚親本的基因型，從中篩選出能夠在子代中聚合出優(yōu)勢基因型數(shù)量最多(7 個(gè))的1 對(duì)父母本個(gè)體配對(duì)繁殖及構(gòu)建家系，親本基因型結(jié)果見表2。在家系子代中，G851A 標(biāo)記的基因型均為純合子，C+36A 和U11628 標(biāo)記都不存在優(yōu)勢基因型，在下面的優(yōu)勢基因型數(shù)量統(tǒng)計(jì)中不分析這個(gè)3 個(gè)標(biāo)記，僅統(tǒng)計(jì)其余7 個(gè)標(biāo)記。部分標(biāo)記的基因型檢測結(jié)果見圖1。

表2 10 個(gè)生長標(biāo)記在草魚家系親本中的基因型Tab.2 Genotype of 14 growth related markers in grass crap parents

圖1 A+762G 標(biāo)記基因型檢測圖Fig.1 A+762G marker genotype detection map

2.2 草魚子代基因型分析

對(duì)T+744C、A+762G、C-499G、A117C、C+1042A、U8014 和U2903 標(biāo)記在草魚家系子代中的優(yōu)勢基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)標(biāo)記的優(yōu)勢基因型分布頻率見表3。結(jié)果顯示，C+1042A 標(biāo)記的優(yōu)勢基因型分布頻率最高，在子代中所占比例為51.31%；U8014 標(biāo)記在子代中的優(yōu)勢基因型頻率最低，所占比例為24.35%。不同子代個(gè)體中含有的優(yōu)勢基因型數(shù)量范圍為0～7 個(gè)，其中，具有聚合優(yōu)勢基因型數(shù)量7 個(gè)的個(gè)體數(shù)量是6 尾，而不含優(yōu)勢基因型數(shù)量的個(gè)體數(shù)量為44 尾。所占比例最多的為具有3 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體，占子代總數(shù)的21.99%。全部子代個(gè)體中平均優(yōu)勢基因型的數(shù)量為2.58，相比親本群體的優(yōu)勢基因型平均數(shù)量(1.00)得到顯著提高(P＜0.05)。

表3 不同標(biāo)記中優(yōu)勢基因型的分布頻率Tab.3 The frequency of dominant genotypes of different markers

2.3 草魚生長性狀相關(guān)的優(yōu)勢基因聚合效果分析

對(duì)草魚子代中含有的優(yōu)勢基因數(shù)量及其生長性狀進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，具有7 個(gè)優(yōu)勢基因型組的生長性狀最佳，體質(zhì)量平均值為176.67 g，比不含優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量高36.26%。不含優(yōu)勢基因型的個(gè)體的體質(zhì)量、體長、體高、頭長、尾柄長和尾柄高等5 個(gè)生長性狀平均值均低于其他具有多個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體，且7 個(gè)、6 個(gè)、5 個(gè)、4 個(gè)、3 個(gè)和2 個(gè)優(yōu)勢基因型組均分別與1 個(gè)和0 個(gè)優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)。7 個(gè)優(yōu)勢基因型組與5 個(gè)、4 個(gè)、3 個(gè)和2 個(gè)優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)，6 個(gè)優(yōu)勢基因型組與3 個(gè)和2 個(gè)優(yōu)勢基因型組的平均體質(zhì)量差異顯著(P＜0.05)。

表4 家系子代中所含不同優(yōu)勢基因型數(shù)量的個(gè)體的生長數(shù)據(jù)比較(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.4 Analysis of growth traits of grass carp with different number of pyramiding dominant genotypes (Mean±SD)

3 討論

傳統(tǒng)選育方法主要通過對(duì)表型性狀選擇來進(jìn)行選育改良，選擇效果易受環(huán)境等因素影響。分子標(biāo)記選擇可克服傳統(tǒng)育種技術(shù)的一些不足，提高育種效率和選擇強(qiáng)度(劉福平等, 2008)。分子標(biāo)記分為連鎖標(biāo)記和功能標(biāo)記，應(yīng)用連鎖標(biāo)記經(jīng)常達(dá)不到育種目的，且連鎖標(biāo)記可能受遺傳背景的限制，無法應(yīng)用于非多態(tài)群體(孫立亭等, 2019; Fujiiet al, 2000)。功能標(biāo)記是指從影響性狀變異基因的功能域開發(fā)出來的多態(tài)性標(biāo)記，利用功能性標(biāo)記開展分子標(biāo)記輔助選擇，對(duì)基因本身進(jìn)行選擇，從而保證了選擇的準(zhǔn)確性和高效性(李揚(yáng)等, 2016; 陳華增等, 2010; 顧冰寧等, 2018)。本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期利用候選功能基因關(guān)聯(lián)分析研究獲得的與草魚生長性狀相關(guān)10 個(gè)SNP 標(biāo)記作為研究對(duì)象，選擇可聚合出優(yōu)勢基因型最多的1 對(duì)親本構(gòu)建家系。結(jié)果顯示，子代個(gè)體的優(yōu)勢基因型的平均數(shù)量為2.58，顯著高于親本群體的平均優(yōu)勢基因型數(shù)量(1.00)，說明通過目的性挑選親魚進(jìn)行基因聚合育種研究，能夠提高選擇群體中優(yōu)勢基因型的數(shù)量，為后續(xù)利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)開展草魚良種選育提供了科學(xué)依據(jù)。

生長是決定魚類經(jīng)濟(jì)價(jià)值最重要的性狀之一，受眾多功能基因調(diào)控(李勝杰等, 2018)。如果僅僅從單基因入手進(jìn)行分子輔助育種，往往不能達(dá)到全面提高生長性狀的目的。多基因聚合技術(shù)可實(shí)現(xiàn)多個(gè)優(yōu)勢基因的有利整合，達(dá)到培育出生長性狀優(yōu)良的草魚品系(傅建軍等, 2016)。宋易等(2016)在翹嘴鱖(Siniperca chuatsi)“華康1 號(hào)”5 代選育中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1～F5所含優(yōu)勢基因型平均數(shù)量依次增加，且生長速率也隨之增加。徐磊等(2014)分析大口黑鱸優(yōu)勢基因型聚合效果發(fā)現(xiàn)，子代個(gè)體中含優(yōu)勢基因型數(shù)量與生長性狀顯著相關(guān)，且含6 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體平均體質(zhì)量比含1 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體提高34.14%。李紅霞等(2014)在建鯉(Cyprinus carpiovar.Jian)優(yōu)勢基因聚合中發(fā)現(xiàn)，子代含4 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體平均增重比不含優(yōu)勢基因型的個(gè)體快14%。本研究子代個(gè)體所含優(yōu)勢基因型數(shù)量與生長性狀的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，優(yōu)勢基因型聚合數(shù)量與草魚生長性狀呈正相關(guān)，與鱖魚(宋易等,2016)、大口黑鱸(李勝杰等, 2019)、鯉(孫效文等, 2009)的研究結(jié)果一致。含7 個(gè)優(yōu)勢基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量比不含優(yōu)勢基因型的個(gè)體提高36.26%?？梢?，利用多基因聚合技術(shù)將草魚生長相關(guān)的基因聚合，可實(shí)現(xiàn)生長表型性狀的大幅度改良。這也表明，在今后的草魚良種選育過程中，利用分子標(biāo)記技術(shù)直接選擇可聚合草魚生長優(yōu)勢基因數(shù)量多的個(gè)體作為親本進(jìn)行繁育，可取得良好的遺傳改良效果。

多基因聚合過程中，每增加一個(gè)基因的篩選，將會(huì)有一部分材料遭到淘汰，可供挑選的目標(biāo)個(gè)體數(shù)也將大大降低(徐磊等, 2014)。本研究也反映出這種現(xiàn)象，從子代個(gè)體所含的優(yōu)勢基因型的數(shù)量分布結(jié)果來看，含2 個(gè)和3 個(gè)優(yōu)勢基因型個(gè)體數(shù)最多，所占比例分別為21.73%和22.25%；含7 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體數(shù)最少，所占比例為1.57%，可供選擇的數(shù)量相對(duì)較少。孫立亭等(2019)對(duì)水稻稻瘟病抗性進(jìn)行多基因聚合效果分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著含抗病基因數(shù)的增加，對(duì)應(yīng)的材料數(shù)量明顯降低。這可能是由于個(gè)體在含2～3 個(gè)優(yōu)勢基因型時(shí)，其基因型的組成方式存在多樣化，隨著子代含有優(yōu)勢基因型數(shù)目的增加，基因型之間的組合方式隨之減少。后續(xù)可通過擴(kuò)大研究群體或者增加聚合基因的數(shù)量來解決這一問題，從而獲得較多數(shù)量的目標(biāo)群體。由于受客觀條件因素的影響，本研究未能探討多基因聚合育種技術(shù)應(yīng)用于選育中的效果，尚需進(jìn)一步研究。

多基因聚合效果分析所用的7 個(gè)與體質(zhì)量顯著相關(guān)的標(biāo)記均為本實(shí)驗(yàn)前期通過候選基因關(guān)聯(lián)分析方法篩選而獲得的，前期研究結(jié)果顯示，這7 個(gè)標(biāo)記的優(yōu)勢基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量比其他基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量高6.86%～11.00% (曹婷婷等, 2012a、b;樊佳佳等, 2014; 唐小紅, 2015)，其中，A+762G 標(biāo)記對(duì)體質(zhì)量影響作用最大，其優(yōu)勢基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量比非優(yōu)勢基因型個(gè)體高11.00% (唐小紅, 2015)。在本研究的家系子代中，這7 個(gè)標(biāo)記的優(yōu)勢基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量比非優(yōu)勢基因型個(gè)體提高了4.27%～12.11%，其中，A+762G 標(biāo)記的優(yōu)勢基因型個(gè)體與非優(yōu)勢基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量差異最大，優(yōu)勢基因型個(gè)體的平均體質(zhì)量為162.41 g，比其余個(gè)體的平均體質(zhì)量提高了12.11%，本研究結(jié)果與前期的研究結(jié)果基本一致，均反映出A+762G 標(biāo)記對(duì)體質(zhì)量的影響作用最大。A+762G 標(biāo)記位于丙酮酸激酶1 型(PKL)基因上，PKL是糖酵解過程中最關(guān)鍵的催化酶，可催化PEP 轉(zhuǎn)化為丙酮酸，將高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移給ADP生成ATP，從而參與機(jī)體生命活動(dòng)及生長發(fā)育過程(戴超等, 2014)。在草魚基因聚合育種實(shí)踐中可考慮將PKL基因上A+762G 標(biāo)記作為首選目標(biāo)標(biāo)記。

本研究不同基因的組合效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，生長相關(guān)的優(yōu)勢基因型聚合數(shù)量越多，其生長性狀表型值越高，但具有4 個(gè)和3 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體平均體質(zhì)量相差很小(1.24 g)，具有3 個(gè)和2 個(gè)優(yōu)勢基因型的個(gè)體平均體質(zhì)量相差也很小(2.2 g)。優(yōu)質(zhì)肉雞繁殖性能相關(guān)標(biāo)記的聚合基因型的效應(yīng)分析研究中也存在類似結(jié)果(張?jiān)鰳s等, 2013)。推測可能多基因聚合并不是單基因的基因型效應(yīng)的簡單相加，而是不同基因之間存在一定的相互作用，從而影響整個(gè)性狀的形成(李國輝等, 2010)。李紅霞等(2014)分析建鯉ODC1基因與增重相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，其主效SNP 標(biāo)記之間也存在拮抗或協(xié)同作用。李勝杰等(2019)研究大口黑鱸生長相關(guān)標(biāo)記的聚合效果也發(fā)現(xiàn)，基因之間存在互作效應(yīng)，進(jìn)而影響其生長性狀。趙秀華(2012)對(duì)京海黃雞GFBP-1、IGFBP-2和STAT5基因進(jìn)行三基因互作效應(yīng)分析，結(jié)果顯示，三基因聚合效應(yīng)＞二基因聚合效應(yīng)＞單個(gè)基因效應(yīng)，但組合基因效應(yīng)并非是單個(gè)基因型效應(yīng)的簡單累加。上述研究提示，今后的多基因聚合育種要將單基因效應(yīng)分析及不同基因的組合效應(yīng)分析相結(jié)合，選擇最優(yōu)秀和合理的多基因聚合式應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐中。