張怡宇 黃國清 張勇剛 苑召虎 王強(qiáng) 陳小潔 黃建云 李楠 魏亞明

國內(nèi)紅細(xì)胞一般在血庫條件下可保存35天，在這個過程中，會發(fā)生儲存損傷，繼而儲存損傷會影響紅細(xì)胞的壽命及輸注質(zhì)量。紅細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生降解也是儲存損傷中的重要現(xiàn)象之一。泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路是細(xì)胞質(zhì)依賴于ATP的非溶酶體途徑的蛋白質(zhì)降解通路[1]。泛素是一種熱穩(wěn)定蛋白質(zhì)，通過與蛋白質(zhì)的共價酰胺鍵結(jié)合將其降解[2]。在網(wǎng)織紅成熟過程中，細(xì)胞膜的蛋白組成發(fā)生變化，其中微管蛋白和肌動蛋白發(fā)生降解，而這種降解部分由泛素-介導(dǎo)的蛋白水解途徑實現(xiàn)。不僅如此，它還能降解紅細(xì)胞中的游離α-珠蛋白、變性異常的蛋白質(zhì)，而且能降解細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞內(nèi)膜蛋白和細(xì)胞周期蛋白等天然蛋白質(zhì)[2-4]。泛素相關(guān)的酶主要包括：泛素激活酶E1，泛素載體蛋白E2和泛素蛋白連接酶E3，不同E3酶的底物特異性決定了哪些蛋白質(zhì)能發(fā)生降解[5]。

環(huán)狀RNA（circRNA，circular RNA）是一種比線性RNA更穩(wěn)定的環(huán)形分子，是紅細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的天然組成部分[6]。有很多研究發(fā)現(xiàn)circRNA是miRNA海綿，通過多個結(jié)合位點吸附大量miRNA，從而解除miRNA對mRNA的抑制作用，促進(jìn)mRNA表達(dá)[7，8]。circRNA在形成環(huán)化同時會影響其母基因生成線性RNA的豐度，從而達(dá)到調(diào)節(jié)母基因蛋白質(zhì)翻譯的目的。circRNA能與RBP（RNA binding proteins，RNA結(jié)合蛋白）特異性結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)功能。若circRNA發(fā)生聚集，由于其環(huán)形分子可產(chǎn)生三級結(jié)構(gòu)，對與之結(jié)合的大量RBP不僅起到了分類隔區(qū)的支架作用，與mRNA比，也產(chǎn)生了其特有的與多組蛋白質(zhì)結(jié)合的能力，能增加circRNA轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性[9，10]。

本研究發(fā)現(xiàn)有近200個circRNA都與泛素降解的蛋白水解通路相關(guān)，相比其它代謝通路，這個數(shù)量非常巨大?；诖?，本研究對母基因富集在泛素降解的蛋白水解通路的全部circRNA做了統(tǒng)計分析，挑選了組間相比具有統(tǒng)計學(xué)意義的部分circRNA進(jìn)行PCR驗證，并預(yù)測其作為miRNA的海綿功能和RBP結(jié)合的能力。

材料和方法

1 一般資料與實驗分組 血液標(biāo)本為5名25～30歲O型健康合格獻(xiàn)血者的標(biāo)本各200 mL，與CPDA-1保存液混合，過濾去除白細(xì)胞后制成懸浮紅細(xì)胞，分別收集新鮮組0 d、20 d、40 d收集標(biāo)本進(jìn)行試驗。收集方法如下：以（1 000×g，20 min，4℃）為條件進(jìn)行慢速離心，在生物安全柜內(nèi)將血漿層吸走，留取紅細(xì)胞層，用PBS洗滌三次，盡可能去除血小板與血漿。其中3名健康者標(biāo)本用來circRNA測序，所有5名健康者標(biāo)本用來circRNA的RT-qPCR驗證。研究獲廣州市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（K-2018-027-01）。

2 試劑與儀器 紅細(xì)胞保存液CPDA-1購自廣州費森尤斯卡比；PrimeScript RT Master reagent Kit with gDNA Eraser（perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq Master MixⅡ、無酶水均購自日本TaKaRa公司；TRIzol-LS購自美國life公司；RNaseR購自美國Epicentre公司；一次性白細(xì)胞過濾輸血器購自美國pall公司；自動紅細(xì)胞計數(shù)儀購自北京賽科希德公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏公司；低溫高速離心機(jī)購自美國Eppendorf公司；引物序列由上海捷瑞合成；使用qTOWER2.2購自德國analytikjena的PCR儀做qRT-PCR檢測。

3 circRNA高通量測序檢測 5名健康者標(biāo)本的新鮮紅細(xì)胞和4℃儲存20 d紅細(xì)胞分別提取總RNA儲存于–80℃，其中3份進(jìn)行circRNA高通量測序。對0 d組、20 d組、40d組的9份標(biāo)本（9份/組）做高通量測序。該測序用到了QIAquick PCR 純化試劑（QIAGEN，Hilden，Germany），cDNA文庫在Illumina HiSeqTM 4000（Illumina，San Diego，CA，USA）擴(kuò)增和測序。

4 circRNA的生物信息學(xué)方法與流程 用KEGG和GO分析篩選出母基因在泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路中的circRNA。將這些circRNA的類型、來源、新舊進(jìn)行分析，最終完成其功能注釋。用circBase（http：//circbase.org/）與mirTarBase（http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）完成數(shù)據(jù)庫注釋與靶向預(yù)測。然后對cirRNA作用miRNA進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測，所用軟件是mireap（http：//mireap.sourceforge.net/），miranda（https：//sourceforge.net/projects/mireap/），targetscan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）。并將miRNA可能作用的mRNA也進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，所用軟件是mirTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。對circRNA預(yù)測其結(jié)合RBP的能力，所用軟件是circRNA interactome（https：//circinteractome.nia.nih.gov）。本測序數(shù)據(jù)的fasta文件及fastq文件已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲取地址：https：//dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA698240，https：//dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA698384。

5 circRNA、miRNA、mRNA表達(dá)量的測定 測定miRNA 的相對表達(dá)量采用 qRT-PCR 方法，具體方法參考文獻(xiàn)[11]。circRNA的引物如表1所示，miRNA及mRNA引物設(shè)計用軟件prime3（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/）完成。

表1 qRT-PCR實驗的引物

6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件和Graphpad Prism5軟件行獨立樣本t檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 測序結(jié)果分析 經(jīng)KEGG分析和GO分析顯示，儲存紅細(xì)胞中與泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路相關(guān)的circRNA有近200種，其中大部分circRNA為未命名circRNA，即未被circBase數(shù)據(jù)庫收錄的novel開頭命名的circRNA，由本次測序研究首次發(fā)現(xiàn)。20 d組與0 d（新鮮）組對比，統(tǒng)計學(xué)上表達(dá)上升的circRNA有：hsa_circ_0036044，hsa_circ_0024173，表達(dá)下降的有：hsa_circ_0007112，hsa_circ_0035729，hsa_circ_0035761，hsa_circ_0044231，40 d組與0 d（新鮮）組對比表達(dá)上升的有hsa_circ_0035731，表達(dá)下降的有：hsa_circ_0002502，hsa_circ_0004724，hsa_circ_0041555。40 d組與20 d組對比表達(dá)上升的有：hsa_circ_0019567，hsa_circ_0007112，hsa_circ_0035761，hsa_circ_0044231，hsa_circ_0028196，hsa_circ_0002814，表達(dá)下降的有：hsa_circ_0024173。（圖1）。

圖1 circRNA分組聚類圖

表2 circular RNA統(tǒng)計表

2 生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果 利用circBase和mirTarBase軟件預(yù)測，共發(fā)現(xiàn) circRNA-miRNA 13組，其中hsa_circ_0036044能海綿吸附hsa-miR-6766-5p，hsa_circ_0024173能海綿吸附hsa-miR-25-3p，hsa_circ_0035761能海綿吸附hsa-miR-4530，hsa_circ_0044231能海綿吸附hsa-miR-1296-3p和hsamiR-5698，hsa_circ_0002502能海綿吸附hsa-miR-6085，hsa_circ_0004724能海綿吸附hsa-miR-3944-5p，hsa_circ_0041555能海綿吸附hsa-miR-433-3p，hsa_circ_0028196能海綿吸附hsa-miR-4299和hsamiR-7-5p，hsa_circ_0002814能海綿吸附hsa-miR-4675。hsa-miR-4530能靶向作用于TRAF2（TNF receptor-associated factor 2，TNF受體相關(guān)因子2），見表3。

表3 與circRNA結(jié)合的miRNA

circRNA interactome數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，在泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路里，具有統(tǒng)計學(xué)意義的大部分circRNA可結(jié)合多個RBP，只有2個circRNA僅結(jié)合一個RBP，即EIF4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，真核翻譯起始因子4A3），見表4。hsa_circ_0036044、hsa_circ_0007112、hsa_circ_0035729、hsa_circ_0035761、hsa_circ_0044231、hsa_circ_0028196、hsa_circ_0002814都與EIF4A3具有多個結(jié)合位點，有很強(qiáng)的結(jié)合能力。此外，hsa_circ_0028196和hsa_circ_0036044與U2AF65（U2 small nuclear ribonucleoprotein auxiliary factor 65，U2小核糖核蛋白輔助因子65）；hsa_circ_0028196與AGO2（argonaute RISC catalytic component 2，精氨酸RISC催化組分2）；hsa_circ_0028196與PTB（polypyrimidine-tract-binding protein，多嘧啶束結(jié)合蛋白）；hsa_circ_0002814與TDP43（TAR DNA binding protein 43，TAR DNA結(jié)合蛋白43）也具3個及以上的結(jié)合位點。

表4 與circRNA結(jié)合的RNA 結(jié)合蛋白（RBP）

3 qPCR驗證的circRNA的表達(dá) 在泛素介導(dǎo)的蛋白石水解通路中具有統(tǒng)計學(xué)意義的circRNA共有13個，我們選取了有結(jié)合多個RBP或miRNA能力的6個circRNA做熒光定量PCR驗證。顯示相對于0 d（新鮮）紅細(xì)胞組，儲存20 d組的hsa_circ_0036044和hsa_circ_0024173表達(dá)量上升，hsa_circ_0035761表達(dá)量下降，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。（P＜0.001，圖2）。相對于新鮮紅細(xì)胞組，儲存40 d組的hsa_circ_0002502表達(dá)量下降，且具有統(tǒng)計學(xué)意義。（P＜0.05，圖2）。相對于儲存20 d組，儲存40 d組hsa_circ_0024173表達(dá)量下降，且具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義。（P＜0.01，圖2），hsa_circ_0035761和hsa_circ_0028196表達(dá)量上升，且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。（P＜0.001，圖2）。

圖2 circRNA的表達(dá)量變化（n=5）

4 qPCR驗證預(yù)測的靶miRNA的表達(dá) 由于circRNA能海綿吸附miRNA，而miRNA能靶向作用于mRNA的性質(zhì)，許多研究證實了ceRNA機(jī)制的存在。根據(jù)ceRNA機(jī)制原理，circRNA和mRNA的表達(dá)量變化應(yīng)是同一方向，而circRNA和miRNA的表達(dá)量變化應(yīng)是相反方向。hsa-miR-4530在儲存紅細(xì)胞芯片檢測中存在[12]。熒光定量PCR顯示相對于新鮮紅細(xì)胞組，儲存20 d組的hsa-miR-4530的表達(dá)量上升，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），儲存40 d組相對于儲存20 d組的hsa-miR-4530的表達(dá)量下降，且具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖3）。

圖3 miRNA的表達(dá)量變化（n=5）

5 qPCR驗證的預(yù)測的靶mRNA的表達(dá)量 對hsa-miR-4530預(yù)測得到的靶mRNA，即TRAF2進(jìn)行熒光定量PCR檢測。顯示相對于新鮮紅細(xì)胞組，儲存20 d組的TRAF2表達(dá)量下降（P＜0.01），儲存40 d組相對于儲存20 d組的TRAF2的表達(dá)量上升，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖4）。

圖4 mRNA的表達(dá)量變化（n=5）

討 論

已有研究表明紅細(xì)胞儲存27天時，circRNA豐度高于相應(yīng)mRNA的豐度，而且證實了紅細(xì)胞是脫核后產(chǎn)生了大量的circRNA富集現(xiàn)象[13]。circRNA的產(chǎn)生更不是一個隨機(jī)事件，在造血細(xì)胞中每個基因檢測到的circRNA變體數(shù)量與每個轉(zhuǎn)錄本的外顯子數(shù)量之間沒有明顯的相關(guān)性[14]。這些都暗示了circRNA有可能精細(xì)化調(diào)節(jié)紅細(xì)胞儲存損傷的生理過程。本研究選取了在儲存損傷中發(fā)揮重要作用的泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路的circRNA表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)了有近200個cirRNA的母基因富集在這條通路且具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，相比其他通路而言數(shù)量十分巨大。有部分circRNA如hsa_circ_0036044、hsa_circ_0035729只在20 d與0 d對比時表達(dá)量變化明顯，呈現(xiàn)了儲存前期的變化。有部分circRNA如hsa_circ_0019567、hsa_circ_0028196、hsa_circ_0002814只在40 d與20 d對比時表達(dá)量變化明顯，呈現(xiàn)了儲存后期的變化。而hsa_circ_0035731、hsa_circ_0002502、hsa_circ_0004724、hsa_circ_0041555只在40 d時與0 d對比時表達(dá)量變化明顯，呈現(xiàn)一個累積量變的過程。還有部分cirRNA如hsa_circ_0024173、hsa_circ_0007112、hsa_circ_0035761、hsa_circ_0044231在20 d與0 d及40 d與20 d兩個儲存階段對比，表達(dá)量變化呈反向趨勢。

一般認(rèn)為儲存損傷可由紅細(xì)胞自身代謝產(chǎn)物積累、氧化損傷、紅細(xì)胞凋亡漸增引起。細(xì)胞凋亡會激活胱天蛋白酶（半胱氨酸蛋白酶）的蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)，該事件可導(dǎo)致細(xì)胞最終死亡。泛素介導(dǎo)的蛋白水解在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，無用的和破損的蛋白質(zhì)都通過此途徑降解，并通常需要消耗ATP。紅細(xì)胞雖然沒有核，但它仍能嚴(yán)格精細(xì)的執(zhí)行mRNA翻譯[15]，這些翻譯同樣存在不同程度的調(diào)控。本文發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0035761能海綿吸附hsa-miR-4530，而hsamiR-4530又能靶向作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）。腫瘤壞死因子（TNF）是一種炎癥因子，可通過激活兩種不同的受體TNFR1和TNFR2發(fā)揮其功能。兩種受體都可以激活經(jīng)典的NF-κB和JNK MAP激酶信號傳導(dǎo)，而TNFR2也可以激活非經(jīng)典的NF-κB信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致與炎癥、細(xì)胞增殖和細(xì)胞壽命相關(guān)的基因表達(dá)量發(fā)生變化[16]。TRAF2是TNF-α介導(dǎo)的c-Jun N末端激酶（JNK）激活所必需的，它有助于NF-kappaB的激活并介導(dǎo)抗凋亡信號[17]。在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞中，TRAF2可以與細(xì)胞凋亡蛋白1的抑制劑結(jié)合，抑制某些胱天蛋白酶（caspases）活性，控制某些促凋亡刺激物的表達(dá)量[18]。細(xì)胞凋亡蛋白1在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用表現(xiàn)在能直接結(jié)合caspases，以及通過結(jié)合RING結(jié)構(gòu)域激活E3泛素連接酶[18]。本研究推測在儲存40 d比20 d時，由于紅細(xì)胞的儲存損傷明顯加劇，hsa_circ_0035761出于抗凋亡作用，表達(dá)量明顯增高，解除了hsa-miR-4530對TRAF2抑制作用，使TNFR2表達(dá)量增高。

本研究還表明很多circRNA具有多個RBP結(jié)合位點。真核翻譯起始因子4A3（eukaryotic translation initiation factor 4A3，EIF4A3）是出現(xiàn)頻率最高的RBP。最近的研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中EIF4A3和E2F1可以促進(jìn)circSEPT9的表達(dá)，而circSEPT9表達(dá)的增加與腫瘤晚期預(yù)后不良呈正相關(guān)[19]。EIF4A3通過與MMP9 mRNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，誘導(dǎo)了circMMP9環(huán)化，增加了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中充當(dāng)致癌基因的circMMP9表達(dá)[20]。目前文獻(xiàn)都證明了在各種通路及代謝過程中RBP具有促進(jìn)circRNA生成表達(dá)的功能，并無抑制功能。而處于泛素介導(dǎo)的蛋白水解酶通路中多個circRNA表達(dá)量都增高的現(xiàn)象與它們具有多個RBP結(jié)合能力有待進(jìn)一步研究。

本文選擇了母基因富集在泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路中的circRNA做相關(guān)預(yù)測研究，用PCR證實了它們及相關(guān)把分子的表達(dá)變化，它們不同的表達(dá)變化模式可能暗示了其有精細(xì)調(diào)節(jié)儲存損傷機(jī)制。通過生物信息學(xué)預(yù)測下游的功能，初步展示了circRNA通過miRNA調(diào)控mRNA的生成途徑，RBP促環(huán)化可能是其生成的調(diào)控機(jī)制。盡管母基因來源于泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路中的單個circRNA并不一定作用于泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路，但通過與母基因的調(diào)控關(guān)系去探討它的功能是很主要的一部分。我們的數(shù)據(jù)為紅細(xì)胞儲存損傷中的circRNA分子機(jī)制研究提供了新研究視角，并發(fā)現(xiàn)某些circRNA可能與儲存損傷中抗凋亡密切相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突