毛艷 盧麗 肖輝 劉瀟

急性腎損傷是一種常見的臨床危重病癥，多伴隨有腎纖維化[1]。當(dāng)腎損傷發(fā)生后，氧供應(yīng)突然減少，葡萄糖酵解代謝途徑供能不能滿足機(jī)體需要，加上代謝底物的減少進(jìn)一步加重能量短缺，導(dǎo)致細(xì)胞水腫、細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而引發(fā)一系列細(xì)胞損傷[2，3]。阿德福韋酯可導(dǎo)致腎損傷，機(jī)制與其在腎小管蓄積濃度過高有關(guān)，可用來構(gòu)建小鼠急性腎損傷模型[4，5]。磷酸腺苷激活蛋白酶（adenosine phosphate activating protease，AMPK）被稱為能量代謝的“感受器”，是一種在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)能量代謝的重要蛋白激酶[6，7]。AMPK可通過直接磷酸化細(xì)胞內(nèi)的一系列酶，或通過協(xié)同激活因子、磷酸化轉(zhuǎn)錄因子和協(xié)同抑制因子對(duì)代謝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8，9]。AMPK也可參與骨骼肌、肝臟、胰腺、下丘腦、脂肪等器官和組織的基因合成與蛋白代謝，從而保證機(jī)體的生理平衡[10，11]。本文通過建立阿德福韋酯小鼠急性腎損傷模型，探討AMPK信號(hào)通路在小鼠急性腎損傷發(fā)生中的作用?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)道如下。

資料與方法

1 研究材料 SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠（48只）購(gòu)自本地區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證SCXK（2018-0007）。室內(nèi)溫度20℃～28℃，濕度40%～60%，每籠6只，飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，光線充足，自由攝食攝水。實(shí)驗(yàn)前令動(dòng)物在飼養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)7天。阿德福韋酯片購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)制藥廠（國(guó)藥準(zhǔn)字H20100172，批號(hào)20194422）。GAPDH內(nèi)參抗體與AMPK、Keap-1多克隆抗體購(gòu)自Sigma公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

2.1 小鼠分組與處理：將所有小鼠隨機(jī)分為兩組，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各24只。對(duì)照組：用等滲鹽水進(jìn)行灌胃處理。實(shí)驗(yàn)組：采用阿德福韋酯40 mg/kg灌胃處理，1次/周，持續(xù)2次。

2.2 檢測(cè)指標(biāo)：在處理后2周、4周、6周各處死8只小鼠。①將血液標(biāo)本加入離心管，靜置30 min，2 500 r/min離心15 min，取上層血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定尿素氮（BUN）與肌酐（SCr）水平。②同時(shí)取小鼠的腎臟組織，–70℃冰箱保存，其中部分組織研磨成勻漿后，提取蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒說明書進(jìn)行蛋白定量，再將制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用Western blotting檢測(cè)腎組織中AMPK、Keap-1的表達(dá)，以GAPDH作為內(nèi)參。③另外取部分腎臟組織用4%多聚甲醛固定，然后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作，經(jīng)蘇木精-伊紅染色后，在光鏡下觀察腎組織的病理學(xué)變化，腎臟的病理?yè)p害評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[12]：1分，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；1分，腎間質(zhì)充血；1分，細(xì)胞核固縮；1分，腎小管腔內(nèi)有脫落、壞死的細(xì)胞；1分，上皮細(xì)胞顆粒變性；1分，腎小管顯著擴(kuò)張、細(xì)胞扁平；0分，正常腎小管。分?jǐn)?shù)越高，腎臟病理?yè)p害越嚴(yán)重。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 選擇SPSS 22.00統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件與Prime Graphpad軟件對(duì)計(jì)量數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)比方法為獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為a=0.05。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 腎功能對(duì)比 實(shí)驗(yàn)組處理后2周、4周、6周的血清BUN與SCr水平都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的腎功能對(duì)比（）

表1 兩組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的腎功能對(duì)比（）

2 腎臟組織病理學(xué)評(píng)分對(duì)比 實(shí)驗(yàn)組處理后2周、4周、6周的腎臟組織病理學(xué)評(píng)分都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表2與圖1。

表2 兩組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟組織病理學(xué)評(píng)分對(duì)比（分，）

表2 兩組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟組織病理學(xué)評(píng)分對(duì)比（分，）

圖1 兩組腎臟組織病理特征（HE染色，×400，對(duì)照組：正常狀態(tài)；2周：腎間質(zhì)充血；4周：細(xì)胞核固縮；6周：腎小管腔內(nèi)有細(xì)胞脫落）

3 AMPK與Keap-1表達(dá)水平對(duì)比 實(shí)驗(yàn)組處理后2周、4周、6周的腎臟組織AMPK與Keap-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見表3與圖2。

表3 兩組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟組織AMPK與Keap-1表達(dá)水平對(duì)比（%，）

表3 兩組處理后不同時(shí)間點(diǎn)的腎臟組織AMPK與Keap-1表達(dá)水平對(duì)比（%，）

圖2 AMPK與Keap-1表達(dá)水平

討 論

急性腎損傷在臨床上比較常見，也是臨床危重患者最主要的死亡原因之一[13]。腎臟是除了肝臟以外多種藥物代謝的重要場(chǎng)所，當(dāng)藥物經(jīng)血液進(jìn)入腎臟時(shí)，往往因?yàn)V過而被濃縮，容易導(dǎo)致腎小管受損[14，15]。其中阿德福韋酯對(duì)腎臟的損傷表現(xiàn)為腎小管的結(jié)構(gòu)和功能改變，是構(gòu)建急性腎損傷小鼠模型的常見方法[16]。本研究顯示實(shí)驗(yàn)組處理后2周、4周、6周的血清BUN與SCr水平都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。臨床研究也顯示在使用阿德福韋酯的過程中，表現(xiàn)為腎小球?yàn)V過率下降或SCr上升，提示患者存在腎功能損傷[17]。但是當(dāng)前影響血清BUN與SCr的因素非常多，特別是嚴(yán)重急性腎損傷患者往往存在程度不等的營(yíng)養(yǎng)不良，使得肝臟將肌酸轉(zhuǎn)化為肌酐的能力減弱，導(dǎo)致血清BUN與SCr很難真實(shí)反映腎功能的狀態(tài)[18，19]。

本研究顯示實(shí)驗(yàn)組處理后2周、4周、6周的腎臟組織病理學(xué)評(píng)分都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。腎組織病理形態(tài)學(xué)評(píng)分提示急性腎損傷的程度，其主要表現(xiàn)為腎臟形態(tài)結(jié)構(gòu)顯著改變，可見腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞腫脹和空泡變性，管腔內(nèi)有管型和壞死脫落細(xì)胞，部分腎小管結(jié)構(gòu)損傷，少量管腔內(nèi)有蛋白性液體積聚等。

AMPK內(nèi)含一個(gè)催化性α亞單位和調(diào)節(jié)性β、γ亞單位，AMP結(jié)合到γ亞單位后，使蘇氨酸172位點(diǎn)更易被磷酸化，變構(gòu)激活復(fù)合體，造成胞內(nèi)鈣離子水平變化[20，21]。AMPK可對(duì)低水平ATP做出反應(yīng)，對(duì)補(bǔ)充細(xì)胞 ATP供應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行正向調(diào)控[22]。AMPK-Keap-1信號(hào)途徑在維持機(jī)體細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡方面發(fā)揮重要作用，且該信號(hào)通路廣泛存在于多細(xì)胞生物體內(nèi)，在進(jìn)化上保持高度保守[23]。腎損傷可激活A(yù)MPK，通過減少能量產(chǎn)生保護(hù)腎功能，進(jìn)而削弱細(xì)胞線粒體功能，形成惡性循環(huán)。當(dāng)腎損傷減輕后，Keap-1因子會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核重新與AMPK結(jié)合，并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞質(zhì)，使AMPK的表達(dá)處于低水平[24，25]。本研究顯示實(shí)驗(yàn)組處理后2周、4周、6周的腎臟AMPK與Keap-1蛋白相對(duì)表達(dá)水平都顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明小鼠急性腎損傷可伴隨有AMPK信號(hào)通路的激活。本研究也有一定的不足之處，對(duì)AMPK信號(hào)通路的機(jī)制闡述不夠深入，且樣本數(shù)量較少，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步分析。

綜上，小鼠急性腎損傷可激活A(yù)MPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)AMPK與Keap-1表達(dá)量上升，導(dǎo)致腎臟組織損傷與腎功能下降。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突