張怡宇 黃國(guó)清 王強(qiáng) 張勇剛 苑召虎 陳小潔 黃建云 李楠 魏亞明

在低溫儲(chǔ)存條件下，儲(chǔ)存紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列的變化，也稱為儲(chǔ)存損傷。氧化損傷和代謝障礙是儲(chǔ)存損傷的原因，而ATP減少、2,3-DPG變化、離子泵功能、RBC膜和細(xì)胞骨架的重組和破壞、血紅蛋白和氧化蛋白的結(jié)合、帶3蛋白的降解以及筏蛋白的變化是儲(chǔ)存損傷的具體表現(xiàn)[1]。在儲(chǔ)存過程中積累的部分生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑（BRM）會(huì)充當(dāng)輸血受血者的促炎劑，例如細(xì)胞因子、趨化因子、生物活性脂質(zhì)和代謝產(chǎn)物[2]。如果將這些發(fā)生變化的血制品輸入到患者，有可能引起輸血不良反應(yīng)。在低溫保存條件下，供體紅細(xì)胞的表現(xiàn)存在廣泛的遺傳變異性，所以在組學(xué)基礎(chǔ)上制定新途徑來減少儲(chǔ)存損傷也十分不易[3]。

在全血中，環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是轉(zhuǎn)錄組的天然成分[4]。circRNA呈閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)，在無核細(xì)胞中大量存在。它不易被核糖核酸酶R水解，而且比線性RNA更穩(wěn)定，所以更適宜用作生物標(biāo)記物[5，6]。除此外，circRNA是高效的miRNA海綿，通過不同的結(jié)合位點(diǎn)能吸附多個(gè)miRNA，通過解除miRNA對(duì)mRNA的抑制作用，來促進(jìn)mRNA表達(dá)及蛋白翻譯，參與調(diào)節(jié)多種信號(hào)通路[7，8]。circRNA還可以起到存儲(chǔ)，分類或定位RBP（RNA結(jié)合蛋白）的作用，如Foxo3環(huán)狀RNA與特定蛋白質(zhì)之間的相互作用顯示出可延緩細(xì)胞周期進(jìn)程[4]。

在多數(shù)疾病中，circRNA上調(diào)和下調(diào)與具體的疾病機(jī)制密切相關(guān)。在無核細(xì)胞中，整個(gè)轉(zhuǎn)錄組呈降解趨勢(shì)。已有研究證明在儲(chǔ)存紅細(xì)胞中非編碼RNA之一的miRNA下調(diào)模式更為明顯[9]，而本研究中下調(diào)的circRNA數(shù)量遠(yuǎn)大于上調(diào)的circRNA數(shù)量，研究下調(diào)的circRNA更具代表意義。下調(diào)的circRNA其作為儲(chǔ)存損傷標(biāo)志物的候選者更為合理?；谶@個(gè)背景，本研究對(duì)儲(chǔ)存20 d的紅細(xì)胞和新鮮紅細(xì)胞采用高通量測(cè)序，觀察下降明顯的circRNA的表達(dá)變化及circRNA所對(duì)應(yīng)的miRNA的分子功能，用生物信息學(xué)方法分析下降明顯的circRNA、其靶miRNA及miRNA關(guān)聯(lián)的mRNA并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，預(yù)測(cè)其功能以及作為儲(chǔ)存損傷標(biāo)志物的可能性。

材料和方法

1 一般資料 血液標(biāo)本為5名25～30歲O型健康合格獻(xiàn)血者的標(biāo)本200 mL（人）份，與CPDA-1保存液混合，過濾去除白細(xì)胞后制成懸浮紅細(xì)胞，分別收集新鮮組（0 d）、20 d收集標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)。收集方法如下：以（1 000 g，20 min，4℃）為條件進(jìn)行輕離心，在生物安全柜內(nèi)將血漿層（去除血小板和血漿）吸走，留取紅細(xì)胞層，用PBS洗滌三次。其中3名健康者標(biāo)本用來circRNA測(cè)序，所有5名健康者標(biāo)本用來circRNA的RT-qPCR驗(yàn)證。所有試驗(yàn)均分為0和20 d 2組。研究獲本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（K-2018-027-01）。

2 試劑與儀器 紅細(xì)胞保存液CPDA-1購自廣州費(fèi)森尤斯卡比；0.9%生理鹽水購自佛山雙鶴藥業(yè)；PrimeScript RT Master reagent Kit with gDNA Eraser（perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq Master MixⅡ、無酶水均購自日本TaKaRa公司；TRIzol-LS購自美國(guó)life公司；RNaseR購自美國(guó)Epicentre公司；一次性白細(xì)胞過濾輸血器購自南京雙威公司；自動(dòng)紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀購自北京賽科希德公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海精宏公司；低溫高速離心機(jī)購自美國(guó)Eppendorf公司；引物序列由上海捷瑞合成；使用qTOWER2.2購自德國(guó)analytikjena的PCR儀做qRTPCR檢測(cè)。

3 circRNA高通量測(cè)序檢測(cè) 3名健康者標(biāo)本的新鮮紅細(xì)胞和4℃儲(chǔ)存20 d紅細(xì)胞分別提取總RNA儲(chǔ)存于-80℃，進(jìn)行circRNA高通量測(cè)序。對(duì)0 d組、20 d組的6份標(biāo)本（3份/組）做高通量測(cè)序。

4 circRNA的生物信息學(xué)方法與流程 對(duì)下調(diào)明顯的十個(gè)circRNA的類型、來源、新舊進(jìn)行分析，最終完成其功能注釋。用circBase（http://circbase.org/）與mirTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）完成數(shù)據(jù)庫注釋與靶向預(yù)測(cè)。然后對(duì)cirRNA作用miRNA進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測(cè)，所用軟件是mireap（http://mireap.sourceforge.net/），miranda（https://sourceforge.net/projects/mireap/），targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）。并將miRNA可能作用的mRNA也進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，所用軟件是mirTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。

5 circRNA、miRNA、mRNA表達(dá)量的測(cè)定 采用qRT-PCR方法測(cè)定miRNA的相對(duì)表達(dá)量，具體方法參考文獻(xiàn)[10]。circRNA的引物如表1所示，miRNA及mRNA引物設(shè)計(jì)用軟件prime3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）完成。

表1 qRT-PCR用到的引物

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 16.0軟件和Graphpad Prism5軟件行配對(duì)t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 測(cè)序結(jié)果分析 紅細(xì)胞在儲(chǔ)存20 d對(duì)比0 d中，下調(diào)明顯的10個(gè)circRNA有：hsa_circ_0005413、novel_circ_0002503、hsa_circ_0008937、hsa_circ_0040340、hsa_circ_0003126、hsa_circ_0007995、hsa_circ_0023937、novel_circ_0000402、hsa_circ_0049462、hsa_circ_0028281（圖1）。下調(diào)明顯的前10個(gè)circRNA有3條來自11號(hào)染色體，且這10個(gè)circRNA均來自外顯子（表2）。Novel命名的circRNA表示在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的新circRNA，即目前未被circBase數(shù)據(jù)庫收錄的circRNA。

表2 circular RNA類型統(tǒng)計(jì)表

圖1 circRNA表達(dá)情況熱圖（n=3）

2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果 利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)下降明顯的十個(gè)circRNA中，hsa_circ_0005413能海綿吸附hsa-miR-6748-3p，hsa-miR-6871-5p，hsamiR-7160-5p，其中hsa-miR-6871-5p能靶向作用于BACH1（basic leucine zipper transcription factor 1，

堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子1）、SOD2（superoxide dismutase 2，超氧化物歧化酶2）等mRNA；hsamiR-7160-5p能靶向作用于EIF2AK2（eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2，真核翻譯起始因子2-α激酶2）、CASP8（caspase 8，半胱天冬酶8）等mRNA。hsa_circ_0008937能海綿吸附hsa-miR-6778-3p，hsa-miR-6778-3p能靶向作用于SH3BP5（SH3-domain binding protein 5，SH3-結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白5）、AKAP2（A kinase（PRKA）anchor protein 2，激酶（PRKA）錨蛋白2）、PPP1R12C（protein phosphatase 1，蛋白磷酸酶1）等mRNA。hsa_circ_0040340能海綿吸附hsa-miR-122-5p、hsamiR-3173-5p、hsa-miR-5590-5p，其中hsa-miR-122-5p能靶向作用于MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1，絲裂原激活的蛋白激酶1）、BCL2L1（BCL2-like 12（proline rich），BCL2樣12（富含脯氨酸））、CDK4（cyclin-dependent kinase 4，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4）等mRNA；Hsa-miR-3173-5p能靶向作用于CPEB4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，胞質(zhì)聚腺苷酸化元件結(jié)合蛋白4）、SCAMP2（secretory carrier membrane protein 2，分泌載體膜蛋白2）、CAMKV（CaM kinase-like vesicle-associated，CaM激酶樣囊泡相關(guān)）、ARHGEF2（Rho guanine nucleotide exchange factor（GEF）2，Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）2）。hsa_circ_0007995能海綿吸附hsa-miR-1254、hsa-miR-4534、hsa-miR-6751-5p、hsa-miR-99a-3p，其中Hsa-miR-4534能靶向作用于TMEM214（transmembrane protein 214，跨膜蛋白214）、EMC3（ER membrane protein complex subunit 3，ER膜蛋白復(fù)合物亞基3）、THAP1（THAP domain containing 1，THAP域包含1）、PER2（period circadian clock 2，周期生物鐘2）、SEMA7A（semaphorin 7A，GPI膜錨）、CAPZA1（capping protein（actin filament）muscle Z-line，alpha 1，旋蓋蛋白（肌動(dòng)蛋白絲）肌肉Z線，alpha 1）、MAP1LC3B（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 beta）、ABCA6（ATP-binding cassette 6，ATP結(jié)合盒成員6）、PGM2L1（phosphoglucomutase 2-like 1，磷酸葡萄糖突變酶2樣1）、TMOD3（tropomodulin 3，原肌鈣蛋白3）、PPP2R1B（protein phosphatase 2，regulatory subunit A，beta；蛋白磷酸酶2，調(diào)節(jié)亞基A，β）、TMEM214（transmembrane protein 214，跨膜蛋白214）。novel_circ_0000402能海綿吸附hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-1285-3p、hsamiR-4304，其中hsa-miR-1285-3p能靶向作用于PRSS21（proteaseserine21，蛋白酶絲氨酸21）、MRI1（methylthioribose-1-phosphate isomerase 1，甲基硫代核糖-1-磷酸異構(gòu)酶1）、UFM1（ubiquitin-fold modifier 1，泛素倍數(shù)調(diào)節(jié)劑1）。

3 circRNA的表達(dá)量 熒光定量PCR顯示相對(duì)于新鮮紅細(xì)胞組，儲(chǔ)存20 d組的hsa_circ_0005413、hsa_circ_0008937、hsa_circ_0040340、hsa_circ_0003126、hsa_circ_0007995、hsa_circ_0023937、novel_circ_0000402、hsa_circ_0028281表達(dá)量顯著下降（P＜0.05，表3）。其中novel_circ_0002503和hsa_circ_0049462未被RTPCR所驗(yàn)證，可能因?yàn)槠淦伪容^短。

表3 circRNA的qRT-PCR表達(dá)結(jié)果（，n=5）

表3 circRNA的qRT-PCR表達(dá)結(jié)果（，n=5）

4 miRNA的表達(dá)量 由于circRNA能海綿吸附miRNA，而miRNA能靶向作用于mRNA的性質(zhì)，許多研究證實(shí)了競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA-（competing endogenous RNAs，ceRNA）機(jī)制的存在。根據(jù)ceRNA機(jī)制原理，circRNA和mRNA的表達(dá)量變化應(yīng)是同一方向，而circRNA和miRNA的表達(dá)量變化應(yīng)是相反方向。之前的芯片研究揭示了紅細(xì)胞儲(chǔ)存中miRNA的表達(dá)量變化[9]。本研究在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到的miRNA中，選取了在芯片中表達(dá)量升高的miRNA做qRT-PCR驗(yàn)證。熒光定量PCR顯示相對(duì)于新鮮紅細(xì)胞組，儲(chǔ)存20天組的hsa-miR-7160-5p、hsamiR-122-5p、hsa-miR-4534的表達(dá)量顯著上升（P＜0.05，表4）。

表4 miRNA的qRT-PCR表達(dá)結(jié)果（，n=5）

表4 miRNA的qRT-PCR表達(dá)結(jié)果（，n=5）

5 mRNA的表達(dá)量 在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶mRNA查閱大量文獻(xiàn)。篩選出在儲(chǔ)存損傷中發(fā)揮重大作用的3條mRNA進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。熒光定量PCR顯示相對(duì)于新鮮紅細(xì)胞組，儲(chǔ)存20 d組的CASP8、CDK4、TMOD3顯著下降（P＜0.05，表5）。

表5 mRNA的qRT-PCR表達(dá)結(jié)果（，n=5）

表5 mRNA的qRT-PCR表達(dá)結(jié)果（，n=5）

6 與儲(chǔ)存損傷有關(guān)的circRNA-miRNA-mRNA通路分析 經(jīng)過qRT-PCR驗(yàn)證及文獻(xiàn)查閱，初步發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0005413-hsa-miR-7160-5p-CASP8、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-CDK4、hsa_circ_0007995-hsa-miR-4534-TMOD3軸，參與了儲(chǔ)存損傷的生物學(xué)過程。

討 論

本研究從circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)角度為紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷機(jī)理和預(yù)防提供了新見解。hsa_circ_0005413-hsa-miR-7160-5p-CASP8、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-CDK4、hsa_circ_0007995-hsa-miR-4534-TMOD3軸是本文全新發(fā)現(xiàn)。這3條軸的miRNA分子中，暫未有hsa-miR-7160-5p的研究，miR-122在肝脂肪變性中上調(diào)，與衰老相關(guān)，并在多種人體組織中過表達(dá)[11-13]，hsa-miR-4534在健康人和2型糖尿病血清樣本中的表達(dá)有顯著差異[14]。這3條軸中的mRNA分子中，caspase-3和-8在成熟紅細(xì)胞大量存在，由于存在這些蛋白酶，缺少線粒體凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必需成分如caspase-9、Apaf-1和細(xì)胞色素c的紅細(xì)胞可以進(jìn)入凋亡途徑[15]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclindependent kinase 4，CDK4）在人紅細(xì)胞中存在，CDK4抑制劑能減弱氧化應(yīng)激下的PS暴露，降低紅細(xì)胞凋亡率[16]。（Tropomodulin3，TMOD3）是一種結(jié)合并覆蓋在紅系和非紅系細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白絲尖端的蛋白質(zhì)，TMOD3的破壞會(huì)使紅細(xì)胞生成受損，它介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白重塑對(duì)于成紅細(xì)胞-巨噬細(xì)胞粘附，協(xié)調(diào)細(xì)胞周期與分化以及F-肌動(dòng)蛋白組裝和成紅細(xì)胞去核過程中的重塑中起著重要作用[17]。另外TMOD3對(duì)肌動(dòng)蛋白絲的覆蓋不足可能會(huì)導(dǎo)致尖端的肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)更大，絲長(zhǎng)重新分布導(dǎo)致血影蛋白-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連接不規(guī)則和減弱，導(dǎo)致紅細(xì)胞膜不穩(wěn)定[18]。可以初步推測(cè)，hsa_circ_0007995可通過吸附hsa-miR-4534下調(diào)TMOD3的表達(dá)導(dǎo)致紅細(xì)胞膜不穩(wěn)定性增強(qiáng)。hsa_circ_0005413吸附hsa-miR-7160-5p，下調(diào)CASP8的表達(dá)阻止紅細(xì)胞凋亡通路，hsa_circ_0040340能吸附hsa-miR-122-5p下調(diào)CDK4的表達(dá)，降低紅細(xì)胞凋亡率。hsa_circ_0005413和hsa_circ_0040340可能是潛在的延緩儲(chǔ)存損傷的有益基因。

根據(jù)本研究的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果，未經(jīng)過RT-qPCR驗(yàn)證的hsa_circ_0005413-hsa-miR-6871-5p-BACH1、hsa_circ_0005413-hsa-miR-6871-5p-SOD2、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-MAPK1、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-BCL2L1、hsa_circ_0007995—Hsa-miR-4534-PER2、hsa_circ_0007995—Hsa-miR-4534-SEMA7A途徑有可能在紅細(xì)胞生理過程發(fā)揮了重要作用。例如，轉(zhuǎn)錄因子Bach1可能參與成紅細(xì)胞對(duì)缺鐵狀態(tài)的反應(yīng)，它通過與血紅素的直接結(jié)合而失活[19]。血紅素通過轉(zhuǎn)錄因子Bach1在紅系細(xì)胞中正調(diào)控基因座控制區(qū)域的β-珠蛋白表達(dá)[20]。超氧化物歧化酶2（super oxide dismutases，SOD2）缺乏將導(dǎo)致小鼠紅細(xì)胞變形能力降低和血紅素降解增加[21]。紅細(xì)胞祖細(xì)胞中SOD2的丟失會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化損傷增強(qiáng)，膜變形改變以及紅細(xì)胞存活率降低[22]。絲裂原相關(guān)蛋白激酶1（mitogen-associated protein kinase 1，MAPK1），成紅細(xì)胞巨噬細(xì)胞蛋白（Emp）在紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均表達(dá)，Emp的下調(diào)會(huì)影響絲裂原相關(guān)蛋白激酶1（MAPK1）和胸腺瘤病毒原癌基因（AKT-1）的表達(dá)，從而導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)異常[23]。Bcl-2樣蛋白1（BCL2L1）屬于抗凋亡因子，有間接證據(jù)表明bcl-x可能在紅系細(xì)胞的凋亡中起作用[24]。有研究表明，將c-MYC和BCL-XL轉(zhuǎn)導(dǎo)至多能造血祖細(xì)胞中過表達(dá)，使糖蛋白A（+）成紅細(xì)胞能夠持續(xù)自我復(fù)制[25]。周期生物鐘基因Per2（Period circadian clock genes 2，Per2）具有非晝夜節(jié)律功能，Per2耗竭導(dǎo)致紅細(xì)胞代謝譜發(fā)生重大變化，包括乳酸增加和ATP水平降低，所以它的丟失會(huì)大大減少紅細(xì)胞的壽命[26]。JMH血型系統(tǒng)由6種位于Sema7A蛋白上的抗原組成，（Semaphorin 7A，Sema7A）是攜帶JMH血型抗原的蛋白質(zhì)，參與免疫反應(yīng)，在軸突生長(zhǎng)和引導(dǎo)中起重要作用[27]。

除此以外，有些靶mRNA還能誘導(dǎo)circRNA環(huán)化，即促進(jìn)circRNA的生成。如真核生物起始因子4A3（Eukaryotic initiation factor 4A3，EIF4A3）可誘導(dǎo)circMMP9環(huán)化，并增加了多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中circMMP9的表達(dá)[28]。這種調(diào)控機(jī)制是否在紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷中發(fā)揮作用還需要進(jìn)一步研究。

在本文中，選取了高通量測(cè)序?qū)ircRNA分子進(jìn)行研究。首先，選取下降明顯的十個(gè)circRNA做PCR驗(yàn)證，其次用circBase和mirTarBase完成數(shù)據(jù)庫注釋與靶向預(yù)測(cè)，推測(cè)了circRNA海綿吸附miRNA的潛在功能。第三，將miRNA可能作用的mRNA也進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA通路。本研究的一個(gè)局限是，并未對(duì)所有差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證和靶基因預(yù)測(cè)分析。但是我們的數(shù)據(jù)為紅細(xì)胞儲(chǔ)存損傷中的circRNA分子機(jī)制研究提供了新基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)某些circRNA可能與儲(chǔ)存損傷密切相關(guān)。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突